穴位埋線對多囊卵巢綜合征胰島素抵抗模型大鼠慢性炎癥的療效評價

李慧禎　童麗　陳秀萍　李永平　孫文萍

摘要目的：探討穴位埋線對多囊卵巢綜合征胰島素抵抗（PCOSIR）模型大鼠的療效。方法：將48只雌性SD大鼠按隨機數字表法分為正常組、模型組、二甲雙胍組和穴位埋線組，每組8只。除正常組外，其余各組以項背部皮下注射脫氫表雄酮建立PCOSIR模型。按照每組治療方案進行干預，共28 d。借助HE染色對卵巢組織形態學變化進行觀察;酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法對血清空腹胰島素（FINS）、C反應蛋白（CRP）、黃體生成素（LH）、性激素結合球蛋白（SHBG）和睪酮（T）進行定量，通過相關公式計算穩態模型胰島素抵抗指數（HOMAIR）和游離雄激素指數（FAI）值。結果：與正常組比較，模型組卵巢組織黃體、正常卵泡少見，閉鎖卵泡數增多，閉鎖卵泡內見大量的顆粒細胞核固縮、崩解，顆粒層細胞被擠壓至邊緣，排列無序，見大量囊樣擴張卵泡，且大鼠血清FINS、FBG、HOMAIR、CRP、LH、T及FAI水平顯著升高（P<0.01），SHBG水平降低（P<0.05）。與模型組比較，各觀察組卵巢中黃體量增多，囊泡及閉鎖卵泡減少，顆粒層細胞規律排列，尤其聯合組各級卵泡數量及發育接近正常，未見囊樣改變的卵泡，且大鼠血清FINS、FBG、HOMAIR、CRP、T、FAI、LH水平均顯著降低（P<0.01），SHBG水平升高（P<0.05）。結論：穴位埋線可以改善PCOSIR模型大鼠性激素水平、胰島素抵抗（IR）及慢性炎癥狀態，該療法方便簡潔、安全性高、不良反應少，值得臨床推廣。

關鍵詞穴位埋線;多囊卵巢綜合征;胰島素抵抗;慢性炎癥;C反應蛋白;游離雄激素指數;性激素結合球蛋白

Effect of Acupoint Catgut Embedding on Chronic Inflammation in Rats with Insulin

Resistance Model of Polycystic Ovary Syndrome

LI Huizhen，TONG Li，CHEN Xiuping，LI Yongping，SUN Wenping

（1 Qinghai Provincial Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Research for Glucolipid Metabolic Diseases，

Xining 810001，China; 2 Qinghai Red Cross Hospital，Xining 810000，China）

AbstractObjective：To investigate the therapeutic effect of catgut embedding at acupoint on insulin resistance（PCOSIR） in rats with ovarian syndrome.Methods：All 48 female SD rats were randomly divided into a normal group，a model group，a metformin group and an acupoint catgut embedding group，eight in each group.Except for the normal group，PCOSIR model was established by subcutaneous injection of dehydroepiandrosterone into the rest of the groups.Interventions were according to each treatment plan，lasting for 28 days.Histomorphology changes of ovary were observed by HE staining; ELISA methods were used to quantify serum FINS，CRP，LH，SHBG and keto testosterone（T）.The HOMAIR and FAI values were calculated with relevant formulas.Results：Comparing with the normal group，ovarian corpus luteum，normal follicles were rare in the model group，with the number of atresia follicles increased and a large number of granulosa cell nuclei shrank and disintegrated in atresia follicles，granulosa cells being squeezed to the margin，arranged disorderedly; and a large number of cystic dilated follicles were found in the model group; serum FINS，FBG，HOMAIR，CRP，LH，T and FAI levels in rats increased significantly（P<0.01） and SHBG levels decreased（P<0.05）.When compared with the model group，the corpus luteum increased，vesicles and atresia follicles decreased; granulosa cells were arranged regularly，especially that the number and development of follicles at all levels in the combined group were close to normal level; and no cystic changes were found; the serum FINS，FBG，HOMAIR，CRP，T，FAI，LH level of rats decreased significantly（P<0.01） and SHBG level increased（P<0.05）.Conclusion：Acupoint catgut embedding therapy can improve the level of sex hormones，IR and chronic inflammation in PCOSIR model rats.This therapy is convenient，simple，safe and it has less side effects.It is worthy of being widely popularized in the clinical application.

KeywordsAcupoint catgut embedding; Polycystic ovarian syndrome; Insulin resistance; Chronic inflammation; CRP; FAI; SHBG

中圖分類號：R271.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.04.006

多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）是一種常見的異質性疾病，且多以內分泌紊亂為特征[1]。目前國內育齡期女性PCOS發病率為6%～10%，其中不孕者達30%～60%，嚴重威脅女性健康并影響家庭幸福[23]。大量研究認為胰島素抵抗（Insulin Resistance，IR）是PCOS發病的核心，流行病學顯示50%～70%的PCOS患者存在IR。另外有研究發現PCOS及PCOSIR患者外周血中炎癥介質水平升高，說明該病患者長期處于一種慢性低度炎癥狀態。目前該病西醫治療方法主要有藥物干預和手術治療，但常有服藥后不良反應大和術后附件易粘連等弊端。因此中醫治療PCOS已成為趨勢，其中穴位埋線由針灸理論發展而來，通過對穴位的不間斷多重長久良性刺激，從而調節機體內在平衡，對許多慢性疾病的療效是肯定的?，F代研究發現，穴位埋線能夠能調節多囊卵巢綜合征胰島素抵抗（PCOSIR）大鼠生殖內分泌紊亂，降低雄激素水平，改善大鼠IR情況[45]。還可加速炎癥吸收[6]。本課題組前期研究發現，根據中醫生殖軸選穴針刺或聯合五子衍宗丸可很好地改善PCOSIR大鼠生殖內分泌水平及IR情況[78]。但目前穴位埋線治療PCOSIR伴慢性炎癥的相關報道較少。本實驗沿用本團隊前期選穴方法對癥選穴埋線，觀察其對PCOSIR模型大鼠伴慢性炎癥的療效。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物健康4周齡SD清潔雌性大鼠32只，體質量（60±5）g。購于西安交通大學醫學部實驗動物中心，動物許可證編號：SCXK（陜）2018001。實驗經青海大學醫學院動物福利倫理委員會批準通過（倫理審批號：201801），實驗過程嚴格遵照我國科學技部門頒發的法律文件規范進行。

1.1.2藥物注射用油（上海源葉生物科技有限公司，生產批號：16030510）;脫氫表雄酮（上海源葉生物科技有限公司，批號：16082009）、鹽酸二甲雙胍片（中美上海施貴寶制藥有限公司，生產批號：ACA4682）

1.1.3試劑與儀器FINSElisas試劑盒（批號：EELR2466c）、CRPElisas試劑盒（批號：EELR0022c）、LHElisas試劑盒（批號：EELR0026c）、SHBGElisas試劑盒（批號：EELR0883c）、TElisas試劑盒批號：EELR0155c），以上均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。血糖儀（江蘇魚躍設備醫療股份有限公司，型號：580）、低溫離心機（湖南湘儀有限公司，型號：H2050R）、恒溫箱（上?，槴t實驗設備有限公司，型號：FCD2000）酶標儀（深圳雷杜醫療有限公司，型號：RT6500）。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備適應性飼養2 d后將32只大鼠按隨機數字表法分為正常組、模型組、二甲雙胍組、穴位埋線組。除正常組外，其余各組SD大鼠頸背部皮下注射溶于注射用大豆油的脫氫表雄酮（DHEA）溶液0.2 mL（6 mg/100 g），10 d后通過巴氏染色觀察其陰道上皮細胞形態變化，連續涂片10 d，若此期出現連續角化狀態的陰道上皮細胞，則表明健康大鼠成功誘導為PCOS模型，于當晚9：00對PCOS模型大鼠禁食，12 h后眶靜脈取血。即刻測空腹血糖及空腹胰島素水平，計算HOMAIR，以HOMAIR>2.8為胰島素抵抗標準，進入后續實驗。

1.2.2干預方式正常組按20 mL/kg行飲用水灌胃，1次/d，連續28 d;模型組干預方式同正常組;穴位埋線組選擇脾俞、胰俞、腎俞、關元、中脘、子宮、三陰交行埋線（定位參照“實驗動物穴位圖譜”），線長0.5 cm，1次/周，共4次;二甲雙胍組給予2 mL二甲雙胍溶液灌胃，100 mg/kg，1次/d，連續28 d;治療期間各組繼續注射脫氫表雄酮，以防止其自身恢復排卵。

1.2.3檢測指標與方法經腹腔用水合氯醛進行麻醉，行腹主動脈采血，抗凝管置于離心機，離心15 min（3 000 r/min，離心半徑6 cm），分離血清，放置在-20 ℃冰箱保存，備用。采血結束，大鼠即刻斷頸處死，剝取兩側卵巢，生理鹽水清洗后，一側卵巢以多聚甲醛中固定，另一側卵巢液氮冷凍，存置-86 ℃冰箱保存，備用。

1.2.3.1卵巢形態觀察將固定在多聚甲醛中的卵巢組織常規脫水，石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，蘇木精染色5 min，分化液分化，伊紅染色5 min，脫水，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢采集圖像。治療周期結束后當晚9：00禁食，12 h后眶靜脈取血檢測空腹血糖（FBG）和空腹胰島素（FINS）。

1.2.3.2測定大鼠血清生化指標測定FINS、C反應蛋白（CRP）、黃體生成素（LH）、性激素結合球蛋白（SHBG）和睪酮（T）含量，并計算HOMAIR及游離睪酮（Free Testosterone Index，FAI）指數，FAI=T/SHBG×100。各項指標含量測定嚴格按照ELISA試劑盒操作說明書。

1.3統計學方法采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，其中計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間采用單因素方差分析，多重兩兩比較方差齊時采用LSDt檢驗，方差不齊時采用Tamhane′s T2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1造模期間大鼠陰道脫落細胞形態變化造模組大鼠陰道脫落細胞在2個動情周期（10 d）中呈現連續角化狀態，表明PCOS造模成功。見圖1。

2.2各組大鼠卵巢形態變化正常組：大鼠卵巢組織被膜完整，可見大量黃體，不同階段卵泡發育及數量正常，少量閉鎖卵泡，未見囊樣擴張的卵泡，結締組織排列緊密;模型組：大鼠卵巢組織被膜完整，黃體數量較少，各級卵泡數量減少，正常卵泡少見，閉鎖卵泡數增多，閉鎖卵泡內見大量的顆粒細胞核固縮、崩解，顆粒層細胞被擠壓至邊緣，排列無序，見大量囊樣擴張卵泡;穴位埋線組：大鼠卵巢組織被膜完整，可見大量黃體，各級卵泡數量略減少，個別次級卵泡呈囊樣擴張，顆粒層細胞少量細胞脫落壞死;二甲雙胍組：大鼠卵巢組織被膜完整，可見大量黃體，各級卵泡數量略減少，個別次級卵泡呈囊樣擴張，顆粒層細胞排列整齊。見圖2。

2.3各組大鼠FBG、FINS、HOMAIR及CRP水平變化與正常組比較，模型組大鼠血清FINS、FBG、HOMAIR及CRP水平均顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，二甲雙胍組和穴位埋線組大鼠血清FINS、FBG、HOMAIR及CRP水平均顯著降低（P<0.01）;此2組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3。

2.4各組大鼠LH、SHBG、T、FAI水平變化與正常組比較，模型組大鼠血清LH、T、FAI水平均顯著升高（P<0.01），SHBG水平降低（P<0.05）;與模型組比較，二甲雙胍組、穴位埋線組小鼠血清T、FAI、LH水平均顯著降低（P<0.01），穴位埋線組SHBG水平升高（P<0.05）;二甲雙胍組、穴位埋線組差異無統計學意義（P>0.05）。見圖4。

3討論

近幾年不斷有研究發現，PCOSIR患者長期處于慢性低度的亞臨床炎癥狀態[9]。PCOS及PCOSIR患者無論是否肥胖，炎癥介質水平都有不同程度的升高，但是肥胖會加重慢性低度炎癥狀態[1011]。HA、IR及慢性炎癥之間的相互作用關系至今未曾出現統一定論。有學者發現，PCOS慢性非特異性炎癥性可以通過影響下丘腦垂體性腺軸功能而引起卵巢功能的受損，也可以通過刺激卵巢而誘發高雄激素血癥，同時加重IR[12]。慢性低度炎癥也有可能介導交感神經功能障礙對HA和IR的影響，即IR、HA、交感神經功能障礙和慢性低度炎癥可能在PCOS的病理生理過程中以惡性循環共同作用[13]。Souza Dos Santos等[14]測定PCOS患者炎癥狀態及胰島素抵抗水平后證實PCOS患者CRP及HOMAIR水平升高。CRP是體內最重要的炎癥標志物，其可促進其他炎癥介質合成分泌并且會擴大機體整體的炎癥程度。

中醫學認為，腎虛精虧、沖任不足是PCOS發病的主要原因，二者會影響腎天癸沖任胞宮軸功能。腎為氣之根本，腎氣不足，則使機體正氣虧虛，抵御外邪及祛邪外出作用減弱，是PCOS女性體內微炎癥存在的內在基礎，結合現代臨床研究，張曉甦老師提出該病之所以纏綿難愈、易于反復，與其長期存在的微炎癥狀態密切相關[15]。

穴位埋線的原理當然離不開針灸理論，較普通針刺，穴位埋線則是通過不間斷長久良性刺激，起到疏通經絡、調節陰陽的作用，從而調節機體內在平衡，對許多慢性疾病的療效是肯定的。有研究發現穴位埋線在慢性炎癥方面的作用機制可能是使神經體液系統發揮一系列的調節作用，提高機體的營養代謝、促進血液循環，進而加速炎癥吸收[6]。另外有研究表明穴位埋線可以使PCOS患者的體質量指數（BMI）和IR下降[16]。脾俞、胰俞和腎俞穴，三穴為背腧穴，共奏養胰健脾、補益脾腎、益精填髓之效。電針脾俞和胰俞穴均可有效降低2型糖尿病大鼠的FBG，另外電針胰俞穴可降低2型糖尿病大鼠胰島素抵抗、提高其胰島素敏感指數[17]。腎俞穴為腎之背腧穴，為滋補腎陰的第一要穴。針刺腎俞穴可以通過增加垂體及血清LH、卵泡刺激素（FSH）的含量，即通過調節性激素，使內分泌水平得到恢復[18]。三陰交可同時調理肝、脾、腎三經，也是治療婦科疾病常用的經驗穴，關元穴培元固本、補益下焦;有研究發現對三陰交、關元等穴位電針可改善PCOS大鼠高雄激素血癥、調節雄激素受體的表達，還可改善卵泡發育[1920]。由此推斷對以上穴位進行穴位埋線，也可調節性激素水平，本實驗結果與此相符：子宮穴補益沖任、調攝經血，中脘穴健運脾氣、升清降濁。

實驗結果顯示，對上述穴位進行穴位埋線治療后大鼠卵巢組織可見大量黃體，較模型組囊樣擴張的卵泡數量明顯減少，大鼠體內FAI、T、LH等性激素相關水平、胰島素抵抗指數及CRP水平下調（P<0.01），SHBG水平上調（P<0.05），考慮可能是以上穴位組合后對主要對雄激素起到下調作用，進而改善其胰島素抵抗與慢性炎癥改變;也可能是埋線使神經體液系統發揮一系列的調節作用，使血液循環加速，改善胰島素抵抗，促使炎癥吸收。

綜上所述，選腎俞、胰俞、脾俞、三陰交、關元、子宮、中脘等穴進行穴位埋線聯合覆盆子治療PCOSIR伴慢性炎癥效果顯著。二者聯合后可能同時改善了胰島素抵抗、高雄激素水平及慢性炎癥狀態，但HA、IR及慢性炎癥之間的相互作用關系仍無法明確，可能其中有某種信號通路的參與，因此對于以上三者的關系及可能的相關信號通路還有待進一步研究。

參考文獻

[1]Barrett ES，Sobolewski M.Polycystic ovary syndrome：do endocrinedisrupting chemicals play a role？[J].Semin Reprod Med，2014，32（3）：16676.

[2]Kalhori Z，Soleimani Mehranjani M，Azadbakht M，et al.Ovary stereological features and serum biochemical factors following induction of polycystic ovary syndrome with testosterone enanthate in mice：An experimental study[J].Int J Reprod Biomed，2018，16（4）：267274.

[3]Jiang YC，Ma JX.The role of MiR3243p in polycystic ovary syndrome（PCOS） via targeting WNT2B[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2018，22（11）：32863293.

[4]林鶯.穴位埋線對PCOSIR模型大鼠生殖內分泌和胰島素抵抗的影響[D].廣州：廣州中醫藥大學，2016.

[5]伊凡，田亞黎，尹改珍.穴位埋線療法對多囊卵巢大鼠FSH、LH等性腺功能的影響[J].新疆中醫藥，2013，31（1）：2829.

[6]斯馮佳，楊姣.穴位埋線治療多囊卵巢綜合征的臨床研究進展[J].世界最新醫學信息文摘（連續型電子期刊），2018，18（55）：102103，105.

[7]張瑩，文紹敦，童麗，等.針藥干預對多囊卵巢綜合征胰島素抵抗模型大鼠生殖內分泌及PI3K/Akt信號通路的影響[J].中國高原醫學與生物學雜志，2018，39（1）：2933.

[8]張瑩，曹圣，文紹敦，等.針刺對多囊卵巢綜合征胰島素抵抗大鼠生殖內分泌及磷酸化蛋白激酶B蛋白表達的影響[J].針刺研究，2018，43（10）：622626.

[9]Adams J，Liu Z，Ren YA，et al.Enhanced Inflammatory Transcriptome in the Granulosa Cells of Women With Polycystic Ovarian Syndrome[J].J Clin Endocrinol Metab，2016，101（9）：34593468.

[10]Xu X，Du C，Zheng Q，et al.Effect of metformin on serum interleukin6 levels in polycystic ovary syndrome：a systematic review[J].BMC Womens Health，2014，14：93.

[11]Ghowsi M，Khazali H，Sisakhtnezhad S.Evaluation of TNFα and IL6 mRNAs expressions in visceral and subcutaneous adipose tissues of polycystic ovarian rats and effects of resveratrol[J].Iran J Basic Med Sci，2018，21（2）：165174.

[12]彭孟凡，劉保松，苗明三.補腎法治療多囊卵巢綜合征的理論探討[J].中國實驗方劑學雜志，2019，25（6）：204209.

[13]Shorakae S，Ranasinha S，Abell S，et al.Interrelated effects of insulin resistance，hyperandrogenism，sympathetic dysfunction and chronic inflammation in PCOS[J].Clin Endocrinol（Oxf），2018，89（5）：628633.

[14]Souza Dos Santos AC，Soares NP，Costa EC，et al.The impact of body mass on inflammatory markers and insulin resistance in polycystic ovary syndrome[J].Gynecol Endocrinol，2015，31（3）：225228.

[15]王晴晴，張曉甦，袁田月，等.張曉甦教授從微炎癥論治多囊卵巢綜合征經驗總結[J].浙江中醫藥大學學報，2020，44（2）：178181.

[16]姜梅芳，朱晶瑜，陳朋.穴位埋線聯合中藥對多囊卵巢綜合征患者胰島素抵抗及血清瘦素的影響[J].上海中醫藥雜志，2015，49（2）：5254.

[17]高珊，李瑞，田環環，等.電針“胰俞”穴對2型糖尿病大鼠HPA軸相關激素的影響[J].中國針灸，2014，34（11）：10991105.

[18]張知云，徐東升，王慧，等.大鼠“腎俞”穴區與腎上腺神經支配的相關性研究[J].針刺研究，2018，43（7）：414418.

[19]徐鴿，王茜，張安冬，等.電針不同穴位對多囊卵巢綜合征大鼠高雄激素血癥及卵巢雄激素受體表達的影響[J].針刺研究，2018，43（9）：543549.

[20]徐鴿，張安冬，王茜，等.電針不同穴位對多囊卵巢綜合征大鼠卵泡發育及相關因素的影響[J].針刺研究，2019，44（10）：740746，751.

基金項目：中醫藥高層次人才培訓基地建設項目（國中醫藥人教函[2019]128號）;青海省衛健委中藏醫藥研究課題（2019wjzdx69）——針藥干預對PCOSIR模型大鼠慢性炎癥的分子機制研究

作者簡介：李慧禎（1996.08—），女，碩士研究生在讀，研究方向：針刺效應機制研究，Email：1573788685@qq.com

通信作者：李永平（1978.08—），男，碩士，副教授，研究方向：針灸效應機制研究，Email：liyongping1122@163.com