情志應激激活潛伏單純皰疹病毒1型建立“肝郁化火”動物模型的研究

姜珊　羅卓　梁磊　牛杰　龔海標　李娥　李怡芳　栗原博　何蓉蓉

摘要目的：建立情志應激引起潛伏單純皰疹病毒1型（HSV1）復發的“肝郁化火”動物模型。方法：小鼠通過鼻滴感染HSV1 4周后，采用定量反轉錄聚合酶鏈式反應（qRTPCR）和空斑法分別檢測三叉神經節（TG）中HSV1潛伏相關轉錄體（LAT）的表達和病毒顆粒，確定單純皰疹病毒1型（HSV1）潛伏模型成功建立。小鼠每天拘束應激12 h，持續應激4 d，采用致細胞病變效應（CPE）法和免疫熒光法檢測三叉神經節中HSV1的gB蛋白的表達，檢測情志應激誘導HSV1激活情況。HSV1潛伏小鼠于拘束應激前3 d給予“清肝瀉火”經典方丹梔逍遙散或清肺熱的經典方瀉白散，以方測證判定模型的中醫證型。采用眼球摘除法對小鼠血漿進行取樣，液質色譜質譜法（LCMS）檢測各激素的含量。用Western Blotting法檢測TG中脂質氧化指標4HNE和固有免疫指標干擾素β（IFNβ），腫瘤壞死因子α（TNFα）和白細胞介素6（IL6）蛋白的表達情況。結果：小鼠鼻滴感染HSV1 4周后，可在其三叉神經節中建立潛伏，小鼠拘束4 d后可再次激活。與激活組比較，丹梔逍遙散比瀉白散更能有效降低HSV1的激活率，并能減輕復發性眼部感染。激活組以及丹梔逍遙散組的血漿中皮質酮水平都明顯增加，2組差異無統計學意義。此外，丹梔逍遙散能降低TG中4HNE和IFNβ的表達，并能減少HSV1復發引起的TNFα和IL6炎癥介質蛋白的表達。結論：丹梔逍遙散可增強固有免疫，降低情志應激介導的HSV1重激活，并能減輕HSV1激活復發而引起的氧化應激以及炎癥反應。

關鍵詞丹梔逍遙散;情志應激;單純皰疹病毒1型;潛伏激活;肝郁化火;脂質過氧化;中醫動物模型

Establishing an Animal Model of Emotional Stress Activated Latent HSV1

for TCM Theory “Liver Qi Stagnation Forming Huo”

JIANG Shan，LUO Zhuo，LIANG Lei，NIU Jie，GONG Haibiao，LI E，LI Yifang，LI Yuanbo，HE Rongrong

（1 Jinan University Guangdong Engineering Research Center of Chinese Medicine & Disease Susceptibility，Guangzhou 510632，

China; 2 Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products，College of Pharmacy，Jinan University，Guangzhou

510632，China; 3 School of Traditional Chinese Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

AbstractObjective：To establish an animal model of emotional stress activated latent HSV1，which is suitable for studying the TCM theory of “Liver qi stagnation forming Huo”.Methods：The expression of HSV1 latent associated transcripts（LAT） and virus particles in trigeminal ganglion（TG） were detected respectively by RTqPCR and plaque assay，to confirm the successful establishment of HSV1 latent model in mice after 14 days of nasal infection.To detect the HSV1 activation induced by emotional stress，the mice were daily subjected to restraint stress for 12 hours for 4 days.Following restraint stress，the TG of the mice was collected and the expression of gB protein in TG was measured by cytopathic effect（CPE） and immunofluorescence method.The mice in the latent phase of HSV1 were treated with Danzhi Xiaoyao Powder which was a classic recipe for clearing liver heat or Xiebai Powder that had the effects of clearing lung heat three days before the restraint stress.And the TCM syndromes type of the model was determined by the method of “Syndrome Differentiation through Formula Effect Assessment”.At the same time，the plasma of the mice was sampled by enucleation method，and the content of hormones was detected by LCMS.The expression of lipid oxidation indicator 4HNE and innate immune index IFNβ，TNFα and IL6 proteins in TG were measured by Western Blotting method.Results：HSV1 latent infection could be established in the TG of mice after 4 weeks nasal infection and it could be reactivated after being restrained for 4 days.Compared with the activated group，the Danzhi Xiaoyao Powder could significantly reduce the activation rate of HSV1 and recurrent eye infections than Xiebai Powder.The plasma corticosterone（CORT） level in the reactivated group and the Danzhi Xiaoyao Powder group were increased significantly.However，no significant difference between the two groups was observed.Moreover，the expression of 4HNE and IFNβ in TG was significantly reduced by Danzhi Xiaoyao Powder.Danzhi Xiaoyao Powder can also reduce TNFα and IL6 inflammatory proteins in TG induced recrudescent HSV1.Conclusion：Danzhi Xiaoyao Powder can enhance innate immunity and reduce stressmediated HSV1 reactivation，and it can alleviate the oxidative stress and inflammation response caused by HSV1 reactivation.

KeywordsDanzhi Xiaoyao powder; Emotional stress; HSV1; Latent activation; Liver qi stagnation forming Huo; Lipid peroxidation; Animal model of traditional Chinese medicine

中圖分類號：R275文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.04.005

在中醫理論中，“火”（包括溫、熱）為陽盛之氣所化生，多屬內熱，由情志應激、起居不節、嗜食辛辣、熬夜等因素會造成“上火”。情志內傷，抑郁不暢，影響機體陰陽及臟腑的生理平衡，造成氣機郁結，氣郁日久則從陽化熱，火熱內生，即“五志過極化火”，最常見的是“肝郁化火”[1]。“肝郁化火”是情志致病的核心內容，是一種病機，也是一種證候，是指情志不遂，引起肝氣郁結，郁久而轉化成“上火”的狀態。然而，至今為止沒有適合研究“肝郁化火”的動物模型，也限制了“清肝瀉火”中藥藥效的表征和機制研究。肝郁化火廣泛存在于各種相關疾病的病理過程中，是情志致病病機轉變的關鍵環節，由單純皰疹病毒1型（Herpes Simplex Virus Type 1，HSV1）復發感染引發的口唇皰疹（中醫稱“熱瘡”）是“肝郁化火”最為常見的癥狀之一[2]。

HSV1是一種至少能夠編碼80種蛋白的雙鏈DNA病毒，并將人類作為其唯一的天然宿主[3]。HSV1在人群中普遍存在，據流行病學統計，HSV1的全球感染率接近90%。HSV1經皮膚黏膜感染后，在鼻、口腔和眼睛等處引起皰疹性的病變[4]。尤為重要的是，在引起原發感染后，少量的病毒能進入神經末梢并沿軸突逆行至神經元胞體，并在中樞神經系統建立終身的潛伏感染[5]。當機體處于情志抑郁不暢，易形成肝氣郁結，郁久而化火，導致肝臟陽熱亢盛，氣火上沖，圍繞肝經巡行的顏面部位形成“火熱”癥狀。如眼部紅腫、口唇皮膚黏膜交界處反復出現成群小皰并伴有刺痛、發紅、腫脹、發癢或灼熱感，充滿液體的水泡形成后可迅速破潰，遺留潰瘍并結痂，這些癥狀與潛伏的HSV1病毒復發癥狀高度相似，嚴重者可進一步引發角膜炎、腦炎等其他嚴重疾病。于是，我們從情志應激導致HSV1復發感染的角度來建立“肝郁化火”的研究模型。在本研究中采用了拘束應激模型來模擬情志應激，該應激模型被認為是可以更好理解中醫“肝”的功能，并被建議用于肝郁研究，因其可能有利于模擬或說明情志致病的部分過程。丹梔逍遙散由牡丹皮、梔子、柴胡和茯苓等9味藥材組成，具有抗炎解熱、疏肝解郁的功效，是治療肝郁化火證的經典名方[6]。因此，我們基于“以方測證”在證候模型中應用的依據，采用丹梔逍遙散針對這一模型進行了干預研究，結果顯示給予丹梔逍遙散的小鼠病毒激活復發率明顯下降，復發性眼部炎癥得到緩解。進一步研究表明，丹梔逍遙散并不影響情志應激誘導的皮質酮水平，但能顯著增加干擾素β（IFNβ）的水平和抑制HSV1激活復發引起的脂質氧化和炎癥反應。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物4周齡雄性BALB/c小鼠，購于廣東省醫學實驗動物中心，實驗動物許可證編號：SCXK（粵）20180002。倫理審批號：[2019]倫審批科026號。飼養溫度為25 ℃，相對濕度為55%，12 h明暗交替環境，標準飼料和水喂養。小鼠適應性喂養1周后進行實驗。本研究涉及的動物感染實驗和動物樣本采集在生物安全Ⅱ級（BSL2）實驗室進行，動物飼養于P2實驗室。

1.1.2病毒和細胞本研究用的HSV1毒株（F株）的擴增在Vero細胞上進行。Vero細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養。Vero細胞和HSV1毒株（F株）由暨南大學王一飛課題組饋贈。

1.1.3藥物丹梔逍遙散組成為牡丹皮9 g、梔子9 g、柴胡9 g、茯苓12 g、白術9 g、當歸9 g、白芍12 g、炙甘草6 g、薄荷6 g、生姜3片。瀉白散組成為地骨皮30 g、桑白皮30 g、炙甘草3 g。上述藥物均購于正規藥店，按所列劑量精確稱取。分別按500 mL常規煎制并按人體用量的9倍濃縮定容，使其分別形成相當于生藥含量1.215 g/mL和0.945 g/mL的藥液，4 ℃冰箱保存備用。臨用前置于20 ℃環境下預熱。

1.1.4試劑與儀器超聲粉碎機（北京潤澤康生物科技有限公司，型號：KBS1200）;3K15臺式高速冷凍離心機（Sigma公司，德國，型號：CR1260）;CO2細胞培養箱（賽默飛世爾科技有限公司，美國，型號：120300）;qPCR儀（BioRad公司，美國，型號：1708882AP）;高效液相色譜質譜聯用儀（賽默飛世爾科技有限公司，美國，型號：4.80112.2500）;熒光顯微鏡（尼康公司，日本，型號：ECLIPSE Tis）;蛋白膠成像系統（廣州譽維生物科技儀器有限公司，型號：14T12NPFL161239）;胎牛血清（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：C0234）;DMEM（上海生工生物工程股份有限公司，貨號：E6000080500）;反轉錄試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號：RP110550T）;甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，貨號：F112034）;乙腈（上海麥克林生化科技股份有限公司，貨號：A800362）;gB抗體（Santa Cruz公司，美國，貨號：SC69798）;GAPDH抗體（杭州費德生物技術有限公司，貨號：FD0068）;4HNE抗體（Abcam公司，英國，貨號：ab46545）;IFNβ抗體（Abcam公司，英國，貨號：ab85803）;TNFα抗體（廣州佰匯生物科技有限公司，貨號：200946）;IL6抗體（北京義翹神州科技股份有限公司，貨號：90197RP01200）;山羊抗小鼠IgG（H+L）HPR（杭州弗德生物科技有限公司，貨號：FDM007）;山羊羊抗兔IgG（H+L）HPR（杭州弗德生物科技有限公司，貨號：FDR007）。

1.2方法

1.2.1分組與模型制備分別將BALB/c小鼠隨機分成正常對照組和病毒感染組。用異氟烷輕度麻醉后，用滴鼻的方式給正常對照組小鼠滴入純DMED（20 μL/只），給病毒感染組小鼠滴入相同劑量的HSV1病毒（1×106 PFU）。感染操作結束后，將小鼠放回動物飼養房，待小鼠自然蘇醒。4周后將存活下來的小鼠隨機分為潛伏組、激活組、丹梔逍遙散組和瀉白散組。

1.2.2給藥方法給予激活組、丹梔逍遙散組和瀉白散組拘束應激處理，即將小鼠置于50 mL通風拘束管中，每天拘束12 h，連續拘束4 d。在此期間，所有小鼠禁水禁食。丹梔逍遙散組和瀉白散組于拘束前3 d開始分別灌胃給予上述制備的丹梔逍遙散（12.15 g/kg）和瀉白散（9.45 g/kg），每次灌胃給藥0.2 mL，1次/d，連續給藥1周。潛伏組和激活組給予等體積的生理鹽水。拘束完成后，立即對每組小鼠進行取血取材，用眼球摘除取血法取血，取材部位為三叉神經節。該研究通過動物福利倫理委員會批準。

1.2.3檢測指標與方法

1.2.3.1定量反轉錄PCR（qRTPCR）法檢測小鼠三叉神經節（TG）中病毒基因潛伏相關轉錄本（LAT）的表達用隨機數字表法取正常對照組和潛伏組各3只小鼠的TG組織進行裂解，依照試劑盒方法提取樣本總RNA，定量并檢測樣品RNA純度，將提取的RNA用反轉錄試劑盒合成cDNA，擴增目的基因。逆轉錄反應體系20 μL，反應條件為37 ℃共15 min，85 ℃共5 s，4 ℃;PCR擴增反應體系為20 μL，反應程序為95 ℃共3 min，95 ℃共30 s，60 ℃共30 s，40個循環。引物由上海生工生物有限公司合成。引物序列：18S上游：TGACGTGGACATCCGCAAAG，下游：CTGGAAGG TGGACAGCGAGG擴增片段242 bp;LAT上游：CGGCGACATCCTCCCCCTAAGC，下游：GACAGA CGAACGAAACGTTCCG，擴增片段149 bp。

1.2.3.2空斑法檢測小鼠TG中病毒的表達量將取出的三叉神經節用含2%雙抗的冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3遍，往三叉神經節中加入含10% FBS，1%谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液中，超聲粉碎。將收集到的三叉神經節懸浮液經過3次反復凍融后，接種到Vero單層細胞上，放置于37 ℃，5%CO2培養箱中吸附3 h，棄去上清，用PBS洗3遍，加入含5% FBS，1%谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液，于培養箱中孵育4 d后，收集上清，重新接種到鋪有Vero單層細胞的六孔板中，吸附3 h加入細胞覆蓋液（0.5% FBS+0.5%羧甲基纖維素）1 mL繼續培養7 d后，加入500 μL的4%甲醛溶液固定30 min后，吸棄甲醛固定液，加入1%結晶紫使用液500 μL，染色30 min。自來水沖洗，空斑呈現，計數。

1.2.3.3致細胞病變效應（Cytopathic Effect，CPE）法和免疫熒光法觀察小鼠TG中gB蛋白的表達將取出的TG與Vero細胞共孵育（方法見上一段）后，連續7 d觀察是否有CPE效應，并統計。棄去一半體積培養液，加入500 μL 4%多聚甲醛放置10 min，對細胞進行預固定，然后棄去預固定液體，加入1 mL 4%多聚甲醛放置15 min固定細胞，PBS洗3次，5 min/次。用0.1%的Triton X100透膜15～20 min，PBS洗3次，5 min/次。用5% BSA封閉1 h，PBS洗3次，5 min/次。加入100 μL TOM20（1∶200）一抗孵育液，4 ℃孵育過夜，第2天回收一抗孵育液，PBS洗3次，5 min/次，接著加入100 μL二抗孵育液（1∶300），避光室溫孵育1 h，棄去二抗孵育液，PBS洗細胞3次，5 min/次;加入100 μL抗熒光淬滅劑，在熒光顯微鏡下初步觀察熒光情況，接著使用熒光顯微鏡對其進行觀察拍照，導出并處理數據。

1.2.3.4LCMS法檢測血漿中各激素的含量拘束應激后，進行小鼠眼球摘除取血，取血2.0 mL，在4 ℃，以3 000 r/min的轉速，13.5 cm的離心半徑，離心10 min，取50 μL血漿，加3 μL可的松（1 μg/mL）作為內標，加600 μL甲基叔丁基醚，渦旋2.5 min，取上層，氮氣吹干，加50 μL甲醇復溶，4 ℃ 12 000 r/min，離心半徑8.79 cm離心15 min，取上清，進入液質聯用儀，進行測樣。液相色譜儀配備DAD檢測器。色譜柱：Waters Acquity UPLC HSST3（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），配備Van Guard預柱（1.8 μm，2.1 mm×5 mm）;流動相：0.1%甲酸水溶液（A）乙腈（B）;梯度洗脫程序如下：0～3 min，27%B;9 min，43%B;14 min，53%B;14.5 min，95%B;18.5 min，95%B;19～23 min，27%B，流速：0.25 mL/min;柱溫：35 ℃;進樣量：2 μL。質譜儀配備加熱電噴霧離子源（Heated Electrospray Ionization，HESI）。質譜掃描模式為正離子掃描，一級掃描分辨率為70 000，掃描質量范圍為150～1 000 m/z，最大注射時間為100 ms，二級掃描分辨率為17 500，最大注射時間為50 ms，分離窗口為2 m/z，碰撞能設置為30、40、50 eV。鞘氣設置為35 arb，輔助氣為10 arb，反吹氣為1 arb。噴霧電壓為3.5 kV。毛細管柱溫為320 ℃，輔助氣溫度為350 ℃。

1.2.3.5Western Blotting檢測TG中4羥基壬烯醛婦（4HNE）、干擾素β（IFNβ）、腫瘤壞死因子α（TNFα）和白細胞介素6（IL6）蛋白的表達利用總蛋白提取試劑盒提取各組小鼠TG中的蛋白，根據BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性、上樣、進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉膜60 min。4HNE（1∶1 000）、IFNβ（1∶1 000）、TNFα（1∶1 000）、IL6（1∶1 000）及GAPDH（1∶3 000）一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜;二抗稀釋液室溫孵育2 h。采用ECL發光后膠片暗室曝光顯影。用Image J軟件對圖像進行分析，結果以目的蛋白與內參蛋白GAPDH的光密度比值表示。

1.3統計學方法采用GraphPad Prism 6.0軟件統計分析，組間比較采用單因素方差分析（Oneway ANOVA），以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1情志應激引起潛伏HSV1激活動物模型的建立給小鼠鼻滴接種感染HSV1，4周后建立潛伏感染，然后連續拘束4 d，每天拘束12 h，誘導HSV1激活。見圖1A。在未感染組的TG中沒有檢測到LAT的mRNA，在潛伏組的TG中檢測到LAT的mRNA。見圖2A。同時，用空斑法檢測未感染組和潛伏組的TG中是否存在病毒顆粒。結果如圖2B所示，發現在六孔板中未形成空斑，未感染組和潛伏組的TG中沒有病毒顆粒。在鏡下觀察激活組的Vero細胞腫脹、變圓甚至飄起，正常組和潛伏組的Vero細胞呈梭形，細胞膜界限清晰，胞質透明度好，細胞形態完整，為正常狀態。在熒光顯微鏡下觀察到，激活組gB蛋白呈現綠色熒光，可清晰地檢測到gB蛋白陽性信號。但是，在正常組和潛伏組中，未能檢測到gB蛋白陽性信號。見圖3。

2.2以方測證研究“清肝瀉火”方對情志應激引起潛伏HSV1激活動物模型的干預作用丹梔逍遙散組大部分未形成空斑，激活組和瀉白散組有空斑形成。見圖4A。對每組小鼠進行統計，激活組的病毒激活率為70%，瀉白散組的病毒激活率為60%，表明清“肺熱”方劑瀉白散對該模型沒有明顯的干預作用;而丹梔逍遙散組的病毒激活率為30%，表明清“肝火”方劑丹梔逍遙散能有效抑制情志應激引起的潛伏HSV1激活。見圖4B。在給與小鼠拘束應激后，與激活組比較，丹梔逍遙散組的小鼠眼部感染癥狀明顯減輕。見圖5A。對每組小鼠的眼部炎癥評分進行統計分析，激活組的小鼠角膜炎復發率為40%，丹梔逍遙散組的小鼠角膜炎復發率為10%。見圖5B。

2.3丹梔逍遙散對情志應激復發小鼠應激激素水平的影響23個標準品在檢測線內，檢測到醛固酮、睪酮、孕烯醇酮、皮質酮、脫氧皮質酮和脫氧皮質醇這6種激素。見圖6A。統計結果顯示皮質酮水平明顯升高，其他5種激素無明顯變化。見圖6B。丹梔逍遙散組和激活組的皮質酮水平都顯著升高，但2組差異無統計學意義。見圖6C。

2.4丹梔逍遙散對“肝郁化火”模型小鼠氧化應激、固有免疫和炎癥介質的影響如圖7A所示，與激活組比較，丹梔逍遙散組的4HNE表達明顯降低，即丹梔逍遙散能顯著降低4HNE的表達。如圖7B所示，與激活組比較，丹梔逍遙散組的IFNβ蛋白表達明顯增強，即丹梔逍遙散能顯著增強IFNβ的表達。如圖7C所示，與激活組比較，丹梔逍遙散組的TNFα蛋白和IL6蛋白表達明顯下降，即丹梔逍遙散能顯著減弱TNFα和IL6的表達。

3討論

情志內傷，抑郁不暢，影響了機體陰陽及臟腑的生理平衡，造成氣機郁結，氣郁日久則火熱內生，引起肝郁化火。肝郁化火證主要以火熱之邪上攻頭目所表現出來的面紅目赤，口舌生瘡、面部皰疹等臨床表現為主。這癥狀可能與HSV1的感染有關[78]。情志應激是肝郁化火證的主要發病原因之一[9]，同時也是使HSV1激活復發的重要因素之一[1012]。丹梔逍遙散是治療“肝郁化火”證的經典名方[6]。因此，建立情志應激誘導潛伏HSV1激活的肝郁化火型動物模型，可用于研究情志應激引起病毒易感的機制，并用于評價丹梔逍遙散這類清熱中藥的藥效。

當HSV1處于潛伏期時，LATs是HSV1病毒在潛伏期間唯一大量存在和被轉錄的RNAs[13]。因此，本研究采用定量反轉錄PCR技術，擴增反應中每一個循環擴增產物的量，進行定量分析，監測細胞LAT mRNA表達量的變化。結果在未感染組的TG中沒檢測到LAT mRNA的表達，在潛伏組的TG中檢測到LAT mRNA的表達。空斑形成實驗是病理學研究中一種檢測受試樣品對病毒感染程度影響的經典實驗方法[14]。我們將未感染組和潛伏組的TG均漿，接種到鋪有一層致密Vero細胞的六孔板中，用空斑法檢測病毒顆粒，結果在未感染組和潛伏組都未發現空斑，以上結果說明HSV1潛伏模型建立成功。HSV1編碼的蛋白質分子已經明確的就多于80個，但是如此眾多的編碼基因并不是同時開始工作的，它們遵循一個線性的時間程序，即即刻早期、早期和晚期。而晚期基因編碼的蛋白中有11種包膜糖蛋白，gB就是其中之一。因此，本研究采用細胞病變效應（Cytopathic Effect，CPE）法[15]和免疫熒光法檢測gB蛋白，驗證潛伏HSV1是否激活。為了考察丹梔逍遙散對情志應激引起潛伏HSV1激活動物模型的干預作用，我們采用空斑法檢測激活后小鼠TG中的病毒顆粒。結果在丹梔逍遙散組中大部分未發現空斑，發現激活組的激活率為70%，丹梔逍遙散組的激活率為30%。以上結果說明，丹梔逍遙散明顯降低了HSV1的激活復發率。有趣的是，通過觀察我們發現丹梔逍遙散能減輕HSV1復發性眼部感染。有研究表明，情志的應激狀態會顯著影響機體的激素水平，導致內分泌系統的生理功能紊亂，引起HSV1的再激活[1617]。因此，為了探究丹梔逍遙散是否是通過改變機體的激素水平，而導致HSV1的潛伏激活率降低，我們用LCMS法檢測小鼠血漿中各激素的水平變化。發現激活組和丹梔逍遙散組的皮質酮水平明顯上升，但是這2組之間無顯著性差異。以上結果說明，丹梔逍遙散并不影響拘束應激后皮質酮的水平，這表明其保護作用與皮質酮的分泌水平無關。有研究表明，由HSV1感染的不同細胞和動物模型都會發生氧化損傷[18]。氧化損傷是指當活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）的產生速度高于清除速度，濃度超過生理限度時，就會損傷生物大分子，如ROS氧化生物膜，破壞脂質結構。4羥基壬烯醛（4HNE）是ROS破壞生物膜結構的副產物之一。為了驗證丹梔逍遙散是否能減輕HSV1激活復發引起的氧化損傷，我們用Western Blotting法觀察TG中4HNE的變化情況，結果發現與激活組比較，丹梔逍遙散組的4HNE表達明顯降低，即丹梔逍遙散能顯著降低4HNE的表達。有研究表明，肝郁化火的情志應激狀態可抑制機體對HSV1的固有免疫應答，使固有免疫系統抗病毒作用的代表性細胞因子干擾素β（IFNβ）表達下調[19]。為了驗證丹梔逍遙散是否能增強HSV1的固有免疫應答，我們用Western Blotting法觀察TG中IFNβ蛋白的變化情況，結果表明與激活組比較，丹梔逍遙散組的IFNβ蛋白表達明顯增強，即丹梔逍遙散能顯著增強IFNβ的表達。有研究表明肝氣郁結會導致機體的免疫功能減弱，抵抗力下降，炎癥反應增強，宿主通過機體產生大量炎癥介質，如腫瘤壞死因子α（TNFα）和白細胞介素6（IL6）[20]。為了驗證丹梔逍遙散是否能減弱HSV1激活復發引起的炎癥反應，我們用Western Blotting法觀察TG中TNFα蛋白和IL6蛋白的變化情況，結果發現與激活組比較，丹梔逍遙散組的TNFα蛋白和IL6蛋白表達明顯下降，即丹梔逍遙散能顯著減弱TNFα和IL6的表達。以上結果說明，丹梔逍遙散可增強固有免疫，并能減輕HSV1激活復發而引起的氧化應激和炎癥反應。

本研究成功建立了情志應激引起潛伏HSV1激活復發的“肝郁化火”動物模型，并以“以方測證”為依據，采用丹梔逍遙散針對這一模型進行研究，發現丹梔逍遙散對這一模型有干預作用，可降低HSV1的激活復發率，緩解復發性眼部炎癥，但其并不影響情志應激誘導的皮質酮水平，與皮質酮的分泌水平無關，可能是通過減輕氧化應激和炎癥反應，增強固有免疫來干預潛伏HSV1的激活復發，但其具體的作用機制還有待更深入的探討。目前，臨床上主要用阿昔洛韋和噴昔洛韋等核苷類似物來治療HSV1，但在治療過程會出現不良反應和耐藥性，最重要的是，這些藥物無法對抗HSV1的激活復發感染[21]，目前世界上尚無有效的藥物來阻止潛伏HSV1的重激活[22]。本研究對潛伏HSV1激活復發感染導致的相關疾病的中醫藥防治提供了一定的實驗依據。

參考文獻

[1]朱思睿，羅祥，李怡芳，等.情志“上火”增加“疾病易感性”的研究[J].中國中藥雜志，2018，43（8）：15291535.

[2]汪琴靜，包潔，李思敏，等.“上火”與病毒的相關性探討[J].中國中醫急癥，2015，24（3）：453456.

[3]Bradley H，Markowitz LE，Gibson T，et al.Seroprevalence of herpes simplex virus types 1 and 2United States，19992010[J].J Infect Dis，2014，209（3）：325333.

[4]Piret J，Boivin G.Resistance of herpes simplex viruses to nucleoside analogues：mechanisms，prevalence，and management[J].Antimicrob Agents Chemother，2011，55（2）：459472.

[5]Whitley RJ.Herpes Simplex Virus Infections of the Central Nervous System[J].Continuum（Minneap Minn），2015，21（6 Neuroinfectious Disease）：17041713.

[6]陳蓉蓉.丹梔逍遙散加減聯合情志干預療法治療肝郁化火型不寐的臨床觀察[J].中西醫結合心血管病（連續型電子期刊），2019，7（28）：153154.

[7]孫志毅，宋繼科，畢宏生.抑火清肝退翳湯加減治療肝經風熱型單純皰疹性角膜炎的臨床療效及作用機制[J].中國實驗方劑學雜志，2020，26（11）：124129.

[8]Yan C，Luo Z，Li W，et al.Disturbed YinYang balance：stress increases the susceptibility to primary and recurrent infections of herpes simplex virus type 1[J].Acta Pharm Sin B，2020，10（3）：383398.

[9]Pan MH，Zhu SR，Duan WJ，et al.“Shanghuo” increases disease susceptibility：Modern significance of an old TCM theory[J].J Ethnopharmacol，2020，250：112491.

[10]Becker HC.Influence of stress associated with chronic alcohol exposure on drinking[J].Neuropharmacology，2017，122：115126.

[11]Li W，Luo Z，Yan CY，et al.Autophagic degradation of PML promotes susceptibility to HSV1 by stressinduced corticosterone[J].Theranostics，2020，10（20）：90329049.

[12]Yu W，Geng S，Suo Y，et al.Critical Role of Regulatory T Cells in the Latency and StressInduced Reactivation of HSV1[J].Cell Rep，2018，25（9）：23792389.e3.

[13]Nicoll MP，Proena JT，Efstathiou S.The molecular basis of herpes simplex virus latency[J].FEMS Microbiol Rev，2012，36（3）：684705.

[14]孟繼鴻.細胞單層速成法病毒空斑試驗在單純皰疹病毒分型中的應用[J].南京鐵道醫學院學報，1986，8（2）：7.

[15]王巧利，于立堅，王一飛，等.土貝母苷甲對單純皰疹病毒1型和2型的增殖和基因組復制的抑制效應[J].病毒學報，2019，35（4）：569577.

[16]Ives AM，Bertke AS.Stress Hormones Epinephrine and Corticosterone Selectively Modulate Herpes Simplex Virus 1（HSV1） and HSV2 Productive Infections in Adult Sympathetic，but Not Sensory，Neurons[J].J Virol，2017，91（13）：e0058217.

[17]羅卓，顏暢，李怡芳，等.Ⅰ型單純皰疹病毒潛伏感染及其應激復發[J].中國藥理學通報，2017，33（9）：11851190.

[18]De Chiara G，Marcocci ME，Sgarbanti R，et al.Infectious agents and neurodegeneration[J].Mol Neurobiol，2012，46（3）：614638.

[19]Ashcraft KA，Bonneau RH.Psychological stress exacerbates primary vaginal herpes simplex virus type 1（HSV1） infection by impairing both innate and adaptive immune responses[J].Brain Behav Immun，2008，22（8）：12311240.

[20]雷珊珊，潘小平，徐莉，等.復發性唇皰疹實熱“上火”患者免疫功能變化[J].中華中醫藥學刊，2018，36（12）：28262831.

[21]Viswanathan K，Dhabhar FS.Stressinduced enhancement of leukocyte trafficking into sites of surgery or immune activation[J].Proc Natl Acad Sci U S A，2005，102（16）：58085813.

[22]Johnston C，Gottlieb SL，Wald A.Status of vaccine research and development of vaccines for herpes simplex virus[J].Vaccine，2016，34（26）：29482952.

（2021-01-26收稿本文編輯：吳珊）

基金項目：國家自然科學基金項目（81873209，U1801284，81622050）;珠江創新團隊項目（2017BT01Y036）;珠江學者計劃項目（GDUPS2019）;廣州市科技計劃基礎與應用基礎研究資助項目（907158833068，201903010062）

作者簡介：姜珊（1997.03—），女，碩士研究生在讀，研究方向：中藥藥理學，Email：1005921730@qq.com

通信作者：何蓉蓉（1983.01—），女，博士研究生，教授，博士研究生導師，研究方向：中醫理論基礎和中藥作用機制，Email：rongronghe@jnu.edu.cn