基于網絡藥理學探討香砂六君子湯治療慢性萎縮性胃炎的作用機制

高娜　姚濤　趙赟　李少康　張平安　車志英

摘要目的：運用網絡藥理學的技術分析香砂六君子湯治療慢性萎縮性胃炎的分子機制。方法：通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）搜索香砂六君子湯的藥物成分及靶點，繪制中藥化合物靶點網絡;通過GeneCards、OMIM數據庫篩選疾病相關基因，繪制韋恩圖，獲取共同基因并繪制蛋白質蛋白質相互作用（PPI）網絡進行網絡拓撲分析獲取核心基因;對核心基因進行進一步的基因本體（GO）功能注釋和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析。結果：經過篩選得到香砂六君子湯中藥活性成分137個，潛在作用靶點162個，慢性萎縮性胃炎疾病702個相關靶點，藥物疾病共同靶點51個，經過網絡拓撲分析得到PTGS2、TNF、VEGFA、IL1B、CAT等18個核心靶點，通過GO、KEGG主要富集于對活性氧的反應、細胞對氧化應激的反應等生物過程和腫瘤壞死因子、IL17、Toll樣受體、C型凝集素受體信號通路等通路上。結論：香砂六君子湯可以通過多成分多靶點多通路的機制，抑制“炎癌”轉化治療慢性萎縮性胃炎。

關鍵詞網絡藥理學;香砂六君子湯;慢性萎縮性胃炎;核心基因;基因本體功能注釋;京都基因和基因組百科全書富集分析;“炎癌”轉化

Mechanism of Xiangsha Liujunzi Decoction in Treatment of Chronic Atrophic

Gastritis Based on Network Pharmacology

GAO Na1，YAO Tao，ZHAO Yun，LI Shaokang，ZHANG Pingan，CHE Zhiying

（1 Henan University of Chinese Medicine，Zhengzhou 450046，China; 2 Beijing University

of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

AbstractObjective：To explore the mechanism of Xiangsha Liujunzi Decoction in treating chronic atrophic gastritis by network pharmacology.Methods：The components and targets of Xiangsha Liujunzi Decoction were searched from TCMSP，and the drugcomponenttarget network was plotted.Diseaserelated genes were screened out from GeneCards and OMIM for plotting the Venn diagram.The proteinprotein interaction（PPI） network was delineated based on common genes for network topology analysis，and core genes were obtained.Gene Ontology（GO） functional enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG） pathway enrichment analyses were performed on the core genes.Results：After the screening，137 active components of Xiangsha Liujunzi Decoction，162 potential targets，702 related targets for chronic atrophic gastritis，and 51 common targets were obtained.Eighteen core targets，such as PTGS2，TNF，VEGFA，IL1B，and CAT were obtained by network topology analysis，which were mainly enriched in biological processes，such as the response to reactive oxygen species and cell response to oxidative stress，and signaling pathways，such as TNF，IL17，Tolllike receptor，and Ctype lectin receptor，according to GO and KEGG analyses.Conclusion：Xiangsha Liujunzi Decoction can treat chronic atrophic gastritis through multicomponent，multitarget，and multipathway，and inhibit the “inflammationcancer” transformation of chronic atrophic gastritis.

KeywordsNetwork pharmacology; Xiangsha Liujunzi Decoction; Chronic atrophic gastritis; Core gene; GO gene function annotation; KEGG enrichment analysis; “Inflammationcancer” transformation

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.04.004

慢性萎縮性胃炎（Chronic Atrophic Gastritis，CAG）以胃黏膜萎縮、腺體減少為顯著改變，同時還伴有固有層淋巴細胞、漿細胞浸潤和腸上皮化生，屬胃癌癌前狀態[1]。有研究認為其與胃癌之間存在著由慢性萎縮性胃炎經過腸上皮化生與異型增生逐漸演變為胃腺癌的機制[2]，而異型增生又因高癌變風險被稱為胃癌前病變[3]，故治療CAG對干預“炎癌”轉變機制有重要意義。腫瘤壞死因子（TNF）信號通路在慢性萎縮性胃炎向胃癌轉變的“炎癌”轉變機制中，腫瘤壞死因子α（TNFα）通過抑制胃酸分泌誘導胃癌的發生[4]，故抑制“炎癌”轉變機制，對于治療CAG有特殊意義。

CAG屬于中醫的“痞滿”“嘈雜”“胃脘痛”等疾病。脾胃氣虛為基本病機，脾為之使，胃為之市，故飲食水谷雖盛于胃，而運化則全賴脾土的推動。故脾為胃行其津液者也，所以運化之功能在于脾氣也，更有《諸病源候論》指出“脾胃二氣相為表里，胃受谷而脾磨之，二氣平調，則谷化而能食”，故脾氣虛弱則不利于化谷?，F代人在生活中卻常常以酒為漿，以妄為常，嗜食肥甘厚味，壅滯脾胃，破壞脾胃的升降之功能。清·李用粹《證治匯補·痞滿》“大抵心下痞悶，必是脾胃受虧”痞滿之病與脾胃受損，脾氣虛弱相關[5]。香砂六君子湯出自《古今名醫方論》適用于“氣虛腫滿，痰飲結聚，脾胃不和，變生諸癥者”，為清·羅美根據古今常用名方加減化裁而成[6]，主要組成為人參、白術、茯苓、甘草、陳皮、半夏、砂仁、木香，具有益氣化痰、行氣溫中的作用，主治脾胃虛弱，濕阻氣滯證?，F代藥理研究表明，香砂六君子湯不僅通過緩解痙攣、加強胃腸蠕動、抑制消化道黏膜炎癥治療胃腸疾病，還可以保護胃黏膜、抑菌、抑制小腸過快蠕動[7]。經實驗驗證香砂六君子湯發揮減輕胃黏膜損害，緩解胃黏膜組織炎癥的作用與下調白細胞介素6（IL6）、白細胞介素17（IL17）的表達，并上調ERK1/2的表達，抑制pERK1/2的表達水平有關[8]。其發揮作用的機制還需進一步挖掘，因此本研究擬從網絡藥理學的方法發現其作用機制，為進一步實驗做準備。

1資料與方法

1.1篩選香砂六君子湯有效成分和靶基因在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）中篩選出香砂六君子湯中木香、砂仁、半夏、陳皮、茯苓、白術、人參、甘草的活性成分，活性成分以口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%，類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18為條件進行篩選;然后查閱文獻，去除無對應靶點的成分，得到對應靶基因，然后利用UniProt數據庫將靶基因進行標準化。并利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制中藥化合物靶基因網絡。

1.2尋找CAG疾病靶點制作韋恩圖以“Chronic Atrophic Gastritis”為檢索詞在GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org）、在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，http：//www.omim.org/）數據庫進行篩選，將兩大基因庫中獲取的疾病靶點刪除重復，獲取CAG相關疾病靶基因。利用Venny2.1網絡平臺（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）對藥物靶基因與疾病靶基因繪制韋恩圖，并獲取香砂六君子湯藥物CAG疾病共同基因。

1.3構建蛋白質蛋白質相互作用（PPI）網絡，選擇核心基因利用藥物疾病共同基因在STRING（https：//stringdb.org/）平臺上構建蛋白質蛋白質相互作用（Proteinprotein Interaction，PPI）網絡，選擇蛋白屬種“Homo Sapiens”，以0.4為最低相互作用閾值“Medium Confidence”，并設置其他默認參數。為選擇核心基因利用CytoNCA進行網絡拓撲分析，篩選分析結果中度中心性（Degree Centrality，DC）、介度中心性（Betweenness Centrality，BC）、接近中心性（Centrality，CC）、特征向量中心性（Eigen Vector Centrality，EC）、局部邊連通性（Local Average Connectivity，LAC）等數值，選Degree值2倍中位值，其他選中位值進行篩選，獲取香砂六君子湯CAG核心基因。

1.4進行基因本體（GO）功能注釋和京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析采用R4.0.2軟件對核心基因進行GO基因本體功能注釋和KEGG通路富集分析。對結果設定閾值為qvalue<0.05，其中選取富集基因數生物過程（Biological Process，BP）、細胞組分（Cellular Component，CC）、分子功能（Molecular Function，MF）前10個條目分別繪制柱狀圖進行可視化;KEGG結果根據qvalue<0.05，選取前30條目進行繪制柱狀圖。

2結果

2.1香砂六君子湯主要有效成分篩選結果通過TCMSP平臺檢索到來自香砂六君子湯的化學成分共961個。篩選后得到有效活性成分共144個，5個來自木香，8個來自砂仁，12個來自半夏，5個來自陳皮，6個來自茯苓，3個來自白術，17個來自人參，88個來自甘草，利用Cytoscape 7.2.1軟件制作中藥成分靶點網絡。見圖1。其中柚皮素為陳皮、甘草的共有成分;人參皂甙rh2為人參、陳皮的共有成分;山柰酚為甘草、人參的共有成分;β谷固醇為半夏、人參的共有成分;豆茲醇為木香、砂仁、半夏的共有成分。

2.2CAG疾病相關靶點篩選結果在GeneCard和OMIM數據庫中搜集到727個CAG相關靶點，去重后得到702個靶基因。

2.3繪制香砂六君子湯CAG韋恩圖將702個CAG疾病相關靶點與169個香砂六君子湯藥物靶基因取交集，繪制韋恩圖，得到共同靶基因51個。見圖2。

2.4構建PPI網絡，獲取核心基因將香砂六君子湯藥物與慢性萎縮性胃炎疾病51個共同靶點輸入String網站，選取“Homo sapiens”為蛋白屬種，獲得PPI蛋白互作網絡并進行結果分析，分析得到網絡中共有51個相互作用節點，598條邊。利用Cytoscape 3.7.2軟件中CytoNCA進行網絡拓撲分析，根據篩選條件，篩選得出PTGS2、TNF、VEGFA、IL1B、IL6、MAPK14、MAPK3、CAT等18個核心靶點，作為香砂六君子湯CAG共同基因中的核心基因。見圖3。對應香砂六君子湯中藥化合物靶基因得到26個關鍵化合物，其中人參、陳皮含有人參皂苷rh2，甘草、陳皮含有柚皮素，甘草、人參含有山柰酚，半夏、人參含有β谷甾醇，木香、砂仁、半夏含有豆甾醇，甘草含有甘草酮a、7甲氧基2甲基異黃酮，人參含有花生四烯酸、紫蘇酮A，半夏含有黃芩素。見表1、2，圖4。

2.5藥物疾病核心靶點GO功能注釋KEGG通路富集分析利用R軟件對藥物疾病核心靶基因進行GO基因功能注釋，選擇qvalue<0.05對結果統計，經可視化獲得柱狀圖?？梢娝幬锱c疾病的共同靶基因在GO功能注釋中主要集中在對活性氧的反應、細胞對氧化應激的反應、囊腔、分泌顆粒腔、絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、生長因子受體結合等生物過程。見圖5。使用R軟件對藥物疾病核心靶點進行KEGG通路富集分析，選擇qvalue<0.05對結果統計，經可視化獲得柱狀圖，可見藥物基因共同靶點主要富集在TNF、IL17、C型凝集素受體、HIF1等信號通路中。見圖6。

3.1香砂六君子湯組方闡釋香砂六君子湯的功效為健脾益氣、化痰行滯，可用于治療中焦氣虛，痰濕凝聚，升降失司的疾病。有研究發現，香砂六君子湯可以通過保護胃黏膜、調節免疫功能以抑制或阻斷胃癌前病變[10]。木香不但可抑制炎癥反應、保護胃黏膜、抗腫瘤，還有抗幽門螺桿菌的作用[11]。研究證明砂仁還能夠抑制炎癥反應、抑制血小板聚集來保護胃黏膜[12]。半夏有止嘔、鎮咳、祛痰、抗炎以及抗腫瘤的作用，可以抑制胃癌細胞的生長[13]。而陳皮則不但具有抗腫瘤、降血脂的作用，還可以抗氧、抗菌、調節免疫系統[14]。此外，四君子湯不但可以調控腫瘤細胞的炎癥、增殖，還可以調節腫瘤細胞的凋亡、代謝，治療慢性萎縮性胃炎[15]。

3.2香砂六君子湯分子成分分析香砂六君子湯的關鍵化學成分主要涉及人參皂苷rh2、甘草酮a、7甲氧基2甲基異黃酮、花生四烯酸、紫蘇酮A、黃芩素、柚皮素、山柰酚、β谷甾醇、豆甾醇。其中其中人參皂苷Rh2可以通過線粒體途徑誘導細胞凋亡并且誘導活性氧的產生來抑制胃癌細胞增殖[16]。有研究發現甘草酮a可以通過下調Caspase3，Bcl2的蛋白表達，上調Bax的蛋白表達來誘導胃癌細胞凋亡[17]。β谷茲醇可以通過加強消除氧自由基的能力、增強NO胃黏膜保護因子的水平、減輕TNFα炎癥介質的釋放和聚集等途徑來保護胃黏膜免受阿司匹林水楊酸的損壞[18]。豆茲醇有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、降低膽固醇的作用，其抗腫瘤的作用與它有強效的誘導細胞凋亡有關，通過阻礙IL1β誘導的核因子κB通路來發揮其抑制炎癥介質的釋放，發揮抗炎作用[19]。香砂六君子湯治療CAG可能通過上述成分發揮抗腫瘤、抗炎癥的作用。

3.3香砂六君子湯治療CAG疾病相關蛋白的作用分析通過藥物疾病共同基因PPI網絡進行網絡拓撲分析得到血管內皮生長因子A（VEGFA）、前列腺素G/H合成酶2（PTGS2）、TNF、IL6、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）的自由度較高。TNF是具有多功能的細胞因子，有關研究發現TNF在胃部惡性腫瘤患者血清中表達較高，而TNFα mRNA在胃癌組織中的表達也顯著增強[20]。TNF、IL6等細胞因子參與炎癥反應，以抑制炎癥反應在胃腺體病理機制的萎縮、化生、發育不良和腫瘤轉化過程的作用[21]。楊云等[22]在香砂養胃丸聯合替普瑞酮膠囊治療CAG的臨床研究中實驗中發現，觀察組可以明顯改善患者血清中細胞因子TNFα和IL6的表達。

3.4香砂六君子湯治療CAG生物過程作用預測從GO功能注釋結果得到，藥物疾病核心基因主要富集在肽酰絲氨酸磷酸化的正調控（Positive Regulation Of PeptidylSerine Phosphorylation）、對脂多糖的反應（Response To Lipopolysaccharide）、內質網內腔（Endoplasmic Reticulum Lumen）、分泌顆粒腔（Secretory Granule Lumen）、絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性（Serine/Threonine/Tyrosine Kinase Activity）、細胞因子活性（Cytokine activity）等生物過程。有研究證明絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸激酶參與的蛋白質的可逆磷酸化是細胞代謝、生長、發育、凋亡、癌變以及細胞對應激反應的調控中心，在幾乎所有的生命活動中發揮重要作用[23]。

3.5香砂六君子湯治療CAG潛在作用通路預測分析通過KEGG富集通路結果得到涉及TNF、IL17、C型凝集素受體、缺氧誘導因子1（HIF1）等信號通路。有研究發現TNF具有促進細胞的生長、分化和凋亡以及誘發炎癥等生物學效應，需要細胞凋亡及轉錄因子核因子κB和Jun激酶來激活其信號轉導通路[24]。而Jun激酶激活的信號通路對細胞遷移、增殖、分化、凋亡和對抗不利環境因素等有重要作用[25]。核因子κB還能促進干擾素基因的表達從而發揮其抗病毒的功能[26]。在細胞凋亡信號轉導通路中，誘導細胞凋亡的Caspase蛋白酶信號通路被激活，可以誘導細胞凋亡[27]。有研究證明IL17可以通過分泌細胞因子以抑制胞外細菌或真菌感染的防御反應，此外IL17還可以通過誘導趨化因子將招募樹突狀細胞及殺傷性效應細胞到腫瘤細胞的部位抑制腫瘤細胞[28]。IL17除了可以激活IL6、IL1等炎癥介質外能夠促進TNFα等炎癥介質的表達來誘導防御反應。尤其IL6，可以通過正反饋調節以增強Th17細胞的分化同時可以激活急性期反應的發生[29]。由此推斷，香砂六君子湯可以通過IL17家族信號通路參與炎癥反應，修復胃黏膜，以及TNF信號通路中參與誘導細胞凋亡等作用來治療CAG，并進一步阻斷CAG向胃癌的演變過程。

綜上所述，本研究通過對藥物成分、藥物基因、疾病基因的相關分析，發現香砂六君子湯可能通過人參皂苷rh2、甘草酮a、β谷甾醇、豆甾醇等活性成分作用于PTGS2、TNF、VEGFA、IL1β、CAT等基因，調控TNF和IL17家族信號等通路，進一步調控炎癥反應、細胞凋亡和氧化應激等生物學過程，發揮抑制炎癥反應、抑制腫瘤細胞、抗氧化應激反應、保護胃黏膜的作用，進而通過抑制其“炎癌”轉變機制治療慢性萎縮性胃炎，其作用機制有待藥理實驗的進一步論證。

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（2021-01-20收稿本文編輯：魏慶雙）

基金項目：2018年河南省科技攻關計劃項目（182102310272）;河南省中醫藥科學研究專項課題（2021ZY2154）;2020年河南中醫藥大學重點學科建設項目（1510204420202）

作者簡介：高娜（1994.04—），女，碩士研究生在讀，研究方向：證候智能信息化處理，Email：1296558953@qq.com

通信作者：車志英（1972.11—），女，博士，教授，碩士研究生導師，研究方向：中醫學診斷與臨床，Email：chezy365@126.com