基于肝氣虛證與網絡藥理學探討黃芪柴胡干預肝炎的作用機制

周怡馳　晏軍　李玲　冉云　胡世平　黨志博　蘇曉鵬

摘要目的：從肝氣虛證角度并通過網絡藥理學探討黃芪柴胡干預肝炎的作用機制。方法：檢索中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）等數據庫，篩選黃芪柴胡干預肝炎的活性成分和作用靶點。構建化合物靶點疾病網絡和蛋白質蛋白質相互作用（PPI） 網絡，進行拓撲學分析，篩選關鍵藥效分子和核心靶點。對作用靶點進行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析，并用Cytoscape軟件構建化合物靶點通路網絡。結果：黃芪柴胡通過升補肝氣治療肝炎患者肝氣虛證。經網絡藥理學分析，篩選出黃芪柴胡14個關鍵藥效分子，19個核心作用靶點與其干預肝炎密切相關。分子對接結果顯示，度值前10的核心靶點能與黃芪柴胡的關鍵活性成分形成較穩定的構象，具有良好的結合活性。GO和KEGG結果主要涉及炎癥、氧化應激、細胞增殖等生物學過程。結論：黃芪柴胡或通過槲皮素、山柰酚、芒柄花素等活性成分作用于Toll樣受體、Th17細胞分化、Th1和Th2細胞分化、PI3K/AKT、MAPK、IL17等信號通路，參與調節氧化應激反應、肝臟炎癥反應、細胞增殖等生物學過程，發揮干預肝炎的作用。

關鍵詞黃芪;柴胡;肝氣虛證;肝炎;網絡藥理;分子對接;槲皮素;氧化應激

Mechanisms of Astragalusradix Bupleuri in Intervening Hepatitis Based

on Liver Qi Deficiency Syndrome and Network Pharmacology

ZHOU Yichi，YAN Jun，LI Ling，RAN Yun，HU Shiping，DANG Zhibo，SU Xiaopeng

（1 Dongzhimen Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100020，China; 2 Shenzhen

Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Shenzhen 518172，China）

AbstractObjective：Investigating the theoretical foundation of AstragalusRadix bupleuri in treating patients with hepatitis from liver qi deficiency syndrome and exploring the possible mechanisms of AstragalusRadix bupleuri in intervening hepatitis by using the method of network pharmacology.Methods：Effective components and targets of AstragalusRadix bupleuri in intervening hepatitis were obtained from TCMSP and other databases.Then，“componenttargetdisease” network and proteinprotein interaction（PPI） network were established in Cytoscape and STRING database respectively，to ascertain the key efficacy components and targets.Molecular docking simulations were evaluated through Autodock vina software.Finally，GO and KEGG enrichment analysis were performed，and “compoundtargetsignaling pathway” network was also established in Cytoscape.Results：AstragalusRadix bupleuri can treat patients with hepatitis of liver qi deficiency by lifting and tonifying liver qi.The fourteen core active components and nineteen key targets of AstragalusRadix bupleuri were closely related to the intervention of hepatitis.Molecular docking results indicated that the top 10 key targets of degree values can form stable conformations with key compounds of RB and had favorable binding activities.Go and KEGG analysis revealed that the targets of AstragalusRadix bupleuri in intervening hepatitis significantly enriched in biological processes such as inflammation，oxidative stress，cell proliferation and TLR signaling pathway.Conclusion：AstragalusRadix bupleuri acts on Tolllike receptors，Th17 cell differentiation，Th1 and Th2 cell differentiation，PI3K/AKT，MAPK，IL17 and other signaling pathways through active components such as quercetin，kaempferol，and formononetin.It participates in the regulation of oxidative stress response，liver inflammatory response，cell proliferation and other biological processes，and plays a role in intervening hepatitis.

KeywordsAstragalus; Radix bupleuri; Syndrome of liver qi deficiency; Hepatitis; Network pharmacology; Molecular docking; Quercetin; Oxidative stress

中圖分類號：R285文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.04.001

流行病學資料顯示，肝炎發病率較高，提高肝炎的治愈率和防治慢性肝炎、肝硬化和肝癌的發展是醫學研究的重要方向。在肝炎的治療中，中醫藥具有較大的優勢和前景。黃芪和柴胡廣泛運用于肝炎的治療中。黃芪和柴胡配伍不僅能補益中氣、疏肝解郁，還能升補肝氣，治療肝炎肝氣虛證，但有關研究較少，故本研究擬從肝氣虛證角度探討黃芪柴胡治療肝炎的理論依據，并運用網絡藥理學，分析和預測黃芪柴胡干預肝炎的作用機制，為藥物開發和臨床拓展應用提供參考。

肝氣虛是指肝臟的精氣虛損及功能活動的減退[1]，早在《黃帝內經》就有相關描述，如《素問·上古天真論》云：“七八，肝氣衰，筋不能動?！薄吨T病源候論》中論述較為詳細：“肝氣不足，則病目不明，兩脅拘急筋攣，不得太息，爪甲枯，面青，善悲怒，如人將捕之?！焙笫罋v代醫家對肝氣虛證的論述甚少，究其原因與肝臟的特性密切相關。肝藏血，主疏泄，肝為剛臟，體陰而用陽，其性主升主動，故常見肝陰肝血不足，肝氣肝陽有余。但在當今臨床肝炎患者中，肝氣虛證的臨床表現頗為常見，尤其是疲乏或不耐勞累，正如醫家張伯臾認為：“臨床中肝氣虛、肝陽虛并不少見，在肝炎肝硬化病例中尤多?！备螝馓撟C離不開肝的疏泄、藏血、調暢情志功能失常及外竅失養，因此除了表現為不耐疲勞，還可見肝經所過部位如脅肋隱隱作痛，肝的疏泄不及影響到脾的升清，導致便溏，以及肝氣不舒，情志默默等。

肝炎肝氣虛證的治療重視補益肝氣，同時注重疏肝，既補肝體，又調肝用。張錫純認為，肝主氣化，人之元氣自腎達肝，由肝升發元氣于全身，故有肝為“人身元氣萌芽之臟”“氣化升發之始”之謂。治療上推崇重用黃芪升補肝氣，其認為“黃芪之性溫而上升，以之補肝，原有同氣相求之妙用。愚自臨證以來，凡遇肝氣虛不能條達，用一切補肝之藥皆不效，重用黃芪為主，而少佐以理氣之品，服之覆杯即見效驗?！苯嗅t學者也肯定了黃芪補肝氣的療效[2]。黃芪補肝的同時，補益脾胃之氣。脾胃為后天之本，氣血生化之源，通過脾土榮木，助肝之氣血化生。黃芪還具有補氣升陽、益衛固表、托毒生肌、利水退腫等功效。黃芪的有效成分具有抗炎、改善微循環及肝臟的合成功能、調節免疫，抑制肝炎病毒復制等作用[3]。柴胡能和解表里、疏肝升陽、疏散退熱，其成分柴胡皂素有抗炎、抗過敏、鎮靜、鎮吐等作用，能改善肝功能，抑制乙肝病毒[4]。黃芪配伍柴胡行氣理肝，既補肝體，又能通過順肝疏泄之性，以助生肝氣。

1資料與方法

1.1黃芪柴胡的活性成分及靶點的篩選基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）分別檢索柴胡、黃芪的化學成分，設置閾值口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug Likeness，DL）≥018為限定條件[5]，篩選活性成分，在TCMSP中收集活性成分對應的靶點，利用UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）校正靶點的官方名稱并篩除非人類靶點蛋白。

1.2肝炎相關基因的收集利用OMIM數據庫（http：//www.omim.org/）、TTD數據庫（http：//db.idrblab.net/ttd/）、DisGeNET數據庫（https：//www.disgenet.org/）檢索關鍵詞“Hepatitis”獲取肝炎相關基因，將3個數據庫的結果進行合并，篩選并刪除重復靶點，得到肝炎相關基因。

1.3化合物靶點疾病網絡的構建與分析使用Venny 210工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）繪制韋恩圖，獲得柴胡、黃芪干預肝炎的潛在作用靶點。利用Cytoscape 372軟件（https：//cytoscape.org/）構建化合物靶點疾病網絡，利用“Network Analyzer”軟件對網絡進行拓撲學分析，將點度中心性≥2倍中位數、中介中心性和接近中心性≥1倍中位數的靶點作為本研究得到的關鍵藥效分子[6]。

1.4蛋白質蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建與分析將潛在靶點導入STRING數據庫（https：//stringdb.org/），設置物種為人，獲得潛在靶點的PPI網絡。利用“Network Analyzer”軟件對網絡進行拓撲學分析，計算節點的度值、中介中心性和接近中心性，將滿足度值≥2倍中位數、中介中心性和接近中心性≥1倍中位數的靶點作為核心靶點。

1.5分子對接驗證從Pubchem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）上下載度度值前10的關鍵藥效分子成分的結構文件，從PDB數據庫（http：//www.rcsb.org/）上下載度值前10的核心靶點蛋白的結構文件，使用PyMol軟件對受體和配體分子進行去水、加氫處理，利用Autodock_vina軟件進行分子對接，計算活性成分與靶點蛋白的最低結合能，并利用PyMol軟件對對接結果進行可視化。一般認為，配體與受體結合的構象穩定時能量越低，發生的作用可能性越大，根據文獻報道，結合能≤-50 kcal/mol（1 cal=4184 J）提示關鍵藥效分子和核心靶點具有良好的結合活性[7]。

1.6富集分析及化合物靶點通路網絡的構建基于R語言軟件ClusterProfiler（Version 3120）對作用靶點進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，設定閾值P<005，用R軟件對前20的結果進行可視化，在Cytoscape 372軟件中針對顯著性前20的通路構建化合物靶點通路網絡。

2結果

2.1黃芪柴胡活性成分及其作用靶點、肝炎的靶點在TCMSP數據庫中共檢索到黃芪柴胡活性成分28種及120個作用靶點。見表1。從OMIM、TTD，以及DisGeNET數據庫共獲得肝炎相關基因846個。篩選出41個黃芪柴胡干預肝纖維化的作用靶點。見圖1。

2.2化合物靶點疾病網絡黃芪柴胡干預肝圖1黃芪柴胡和肝炎靶點韋恩圖

炎的化合物靶點疾病網絡。見圖2。網絡共有70個節點和272條邊，其中藍色節點代表靶點，紫色靶點代表黃芪的活性成分，紅色代表柴胡的活性成分，黃色代表黃芪與柴胡共有的活性成分。對網絡進行拓撲學分析后發現，槲皮素（MOL000098）、山柰酚（MOL000422）、刺芒柄花素（MOL000392）、美迪紫檀素（MOL000371）、異鼠李素（MOL000354）等活性成分的度值較高。

2.3PPI網絡和核心靶點黃芪柴胡干預肝炎的PPI網絡。見圖3。網絡包括41個節點、390條邊，節點大小及其顏色根據Degree值排序，Degree值越高，則節點越大、顏色越暗;邊的粗細和顏色根據Combined score排序，Combined score值越高、邊越粗、顏色越暗。網絡拓撲學參數度值中位數為21，中介中心性中位數為0007，接近中心性中位數為0677，VEGFA、IL6、TP53、JUN、MAPK8、MAPK1、PTGS2、EGFR、CCL2、ESR1等19個靶點滿足上述參數值，作為本研究的核心靶點。見表2。

2.4分子對接結果通過Autodock vina軟件計算獲得的最低結合能結果。見圖4。大部分關鍵活性成分與核心靶點蛋白的最低結合能≤-5 kal/mol，說明二者具有較好的結合活性。利用PyMol軟件對

對接結果進行可視化，部分分子對接模式，黃色虛線代表氫鍵，圖中活性成分能與周圍核心靶點蛋白殘基通過氫鍵等分子間作用力形成較穩定的構象。見圖5。

2.5富集分析及化合物靶點通路網絡基于R語言對潛在作用靶點進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，顯著性排名靠前20的結果，GO功能富集分析富集到2 412個GO條目，主要涉及氧化應激反應、對脂多糖的反應、炎癥反應、肝再生、細胞增殖等。共富集到54條KEGG通路，主要涉及TLR、Th17細胞分化、Th1和Th2細胞分化、PI3K/AKT、MAPK、IL17、TNF、HIF1等信號通路。見圖6。化合物靶點通路網絡共有75個節點和312條邊，粉色節點代表KEGG通路，藍色節點代表靶點，紫色節點黃芪獨有的活性成分，紅色節點代表柴胡獨有的活性成分，黃色節點代表柴胡和黃芪共有活性成分。網絡包括了20條KEGG通路、25種活性成分和30個靶點。見圖7。

3討論

本研究發現，黃芪柴胡的活性成分中，槲皮素、山柰酚、芒柄花素、美迪紫檀素、異鼠李素等活性成分作用靶點較多，在PPI網絡中占據關鍵地位。研究發現，槲皮素能通過上調非酒精性脂肪肝炎模型大鼠脂肪細胞衍生激素脂聯素（ADPN）、脂聯素受體2（Adipo R2）表達，有效改善肝功能、血脂，改善大鼠肝組織脂肪變程度，減輕肝臟炎癥[8]。山柰酚具有改善乙酰氨基酚引起的急性肝損傷的作用，其分子機制與抗氧化應激，促進乙酰氨基酚二相代謝和抑制炎癥有關[9]。異鼠李素對由藥物引起的肝細胞損傷具有良好的保護效果，可顯著提升由對乙酰氨基酚引起損傷的肝細胞存活率，提升肝損傷模型中谷胱甘肽、超氧化物歧化酶含量[10]。

通過PPI網絡分析研究可知，VEGFA、IL6、JUN、MAPK8、MAPK1、PTGS2、EGFR、CCL2等靶蛋白的度值高，是黃芪柴胡干預肝炎潛在靶點蛋白PPI網絡的核心靶點，也是其他節點之間的連接紐帶。分子對接模擬進一步驗證了關鍵藥效分子與核心靶點蛋白之間的結合活性，印證了上述靶點在網絡中的重要性。血管內皮生長因子（VEGF）是目前已知作用最強、特異性最高的血管生成調控因子[11]，VEGFA的表達程度與肝組織損傷密切相關，研究發現，VEGFA在阻塞的肝竇緣、擴張的肝竇周圍表達增強，在肝細胞壞死及血管周圍炎癥區陽性，在水樣變性的肝細胞中強陽性表達[12]。IL6是體內重要的炎癥介質，可促進肝內炎癥反應，介導肝細胞損傷，誘導各類細胞分化增殖，使慢性肝臟炎癥持續存在，不斷刺激纖維組織增生[13]，臨床研究顯示，慢性乙肝患者血清IL6水平明顯升高[14]。JUN的激活與乙肝病毒的發展密切相關，正常肝組織中JUN為低水平表達，但在整合乙肝病毒遺傳信息的肝纖維化和肝癌細胞組織中高水平表達[15]。研究表明，表皮生長因子受體（EGFR）抑制劑能通過下調信號轉導及轉錄激活蛋白3（STAT3）磷酸化來抑制乙型肝炎病毒[15]。趨化因子配體2（CCL2）主要趨化單核細胞、記憶性T淋巴細胞和自然殺傷性細胞，使各種炎癥細胞尤其是單核細胞向病變部位聚集在炎癥反應、新生血管生成、損傷修復中均有重要作用[16]。

富集分析和通路分析結果表明，靶點主要涉及活性氧代謝過程的正調控、核質轉運的正調控、DNA結合轉錄因子活性的調節、平滑肌細胞增殖的調節、再生、成纖維細胞增殖等生物過程。此外，本研究中藥物關鍵靶點主要富集的通路為TLR、PI3K/AKT、MAPK、IL17、TNF等通路，這些通路與肝炎的形成和發展相關，參與肝臟炎癥、肝臟纖維化以及細胞凋亡等病理學過程。表明黃芪柴胡干預肝炎活性成分作用的靶點或分布于不同的通路，通過協調各通路發揮作用。研究表明，乙肝病毒逃避宿主先天性免疫可能是由于Toll樣受體（TLR）不能識別該病毒。在急性乙肝病毒感染過程中，TLR激活能阻斷乙肝病毒復制[17]。IL17在多種炎癥反應、免疫介導的慢性乙型肝炎及自身免疫性疾病中發揮作用[18]，參與并激活IL6/STAT3信號途徑來影響慢性乙型肝炎炎癥的發展[19]。TNF是調節細胞生長、分化、誘發炎癥和調控細胞凋亡的因子，當機體發生免疫反應和免疫損傷時，單核巨噬細胞可以合成大量的TNFα，并通過激活免疫級聯反應起到引發炎癥反應的作用[20]。

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（2021-01-26收稿本文編輯：魏慶雙）

基金項目：河北省中醫藥管理局科研計劃項目（2020080）

作者簡介：高云霄（199510—），女，碩士研究生在讀，研究方向：中醫內科脾胃病，Email：2285410658@qqcom

基金項目：國家自然科學基金項目（81973733）

作者簡介：周怡馳（199201—），女，博士研究生在讀，醫師，研究方向：中醫藥防治慢性肝病的臨床與基礎研究，Email：youhuichi@yeahnet

通信作者：胡世平（196505—），男，博士研究生，主任醫師，研究方向：中西醫結合防治肝病的臨床與基礎研究，Email：szhushiping@21cncom