早產和足月新生兒串聯質譜篩查切值的建立

王 瓊，齊志業，姚 勤，段 江，鐘慶華，張彩營，梁 琨

（昆明醫科大學第一附屬醫院新生兒遺傳代謝病篩查中心，云南 昆明 650032）

相較于傳統的一種方法只能檢出一種疾病的生化檢測方法，串聯質譜技術運用一個濾紙干血斑標本，1 次實驗可檢測40 多種指標，篩查數十種氨基酸、有機酸和脂肪酸代謝病，兼具高效性、特異性和敏感性，越來越多的遺傳代謝病通過串聯質譜檢測被診斷。然而正確評估是否患病的主要標準是將檢測結果與切值（cut-off value）進行比較，因此制定適合自己實驗室的篩查切值尤為重要。國內外研究顯示，不同出生胎齡、體重的新生兒氨基酸、肉堿代謝水平存在差異[1-4]，本研究回顧性分析了昆明醫科大學第一附屬醫院新生兒遺傳代謝病篩查中心不同出生胎齡新生兒的干血斑中氨基酸、游離肉堿和酰基肉堿濃度水平，并分別建立其參考區間。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2013 年1 月至2020 年12 月在昆明醫科大學第一附屬醫院新生兒遺傳代謝病篩查中心做串聯質譜篩查的52 526 例新生兒干血斑標本，根據出生時胎齡（gestational age，GA）不同，分為早產組（32 周≤胎齡＜37 周）和正常孕周組（37 周≤胎齡≤42 周），分別有5 694 例、46 832 例。本研究獲得家屬知情同意，并簽署知情同意書。

1.2 樣本采集

按照新生兒疾病篩查技術規范（2010 版）的要求，于生后3～7d 內、充分哺乳6 次后采集新生兒足跟血，滴于whatman 903 號濾紙片，形成直徑≥8mm 的3 個血斑。血片采集后懸空平置，室溫自然干燥成深褐色，塑料袋密封裝好，在5 個工作日內送至新生兒遺傳代謝病篩查中心實驗室，放入4℃冰箱保存備檢。

1.3 試劑、儀器和檢測方法

采用美國PerkinElmer 公司的非衍生化多種氨基酸、肉堿測定試劑盒（neobase non-derivatized MSMS Kit），對濾紙干血斑中的11 種氨基酸、游離肉堿（C0）和31 種酰基肉堿進行檢測，儀器為美國ABI（Applied Biosystems）公司的API3200MDTM 串聯質譜系統，檢測方法按照試劑盒操作說明書進行。

1.4 質量控制

每批次實驗均采用PerkinElmer 公司的非衍生化多種氨基酸、肉堿測定試劑盒內的高低兩種水平質控品進行檢測，結果均符合質控要求。室間質控為每年參加國家衛生健康委員會臨床檢驗中心的新生兒串聯質譜篩查-氨基酸和酰基肉堿的室間質量評價，同時參加美國CDC（Centers for Disease Control and Prevention，CDC）的室間質量評價體系，成績均合格。

1.5 統計學方法

采用SPSS 23.0 軟件進行統計學分析。偏態分布資料以四分位數表示。組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。選用第0.5 百分位值與第99.5 百分位值作為切值的上下限[5]。

2 結果

2.1 兩組一般情況比較

早產組與正常孕周組的性別、采血日齡比較差異均無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組新生兒一般情況比較[n（%）,xˉ±s]Table 1 Comparison of general situation of neonates between the two groups[n(%),xˉ±s]

2.2 不同出生胎齡新生兒氨基酸、游離肉堿和酰基肉堿參考區間的建立

采用第0.5 百分位值與第99.5 百分位值（P0.5～P99.5）作為不同出生胎齡新生兒11 種氨基酸、游離肉堿和30 種酰基肉堿參考區間的上下限，見表2。結果顯示，11 種氨基酸及C0、C2、C3、C4、C5、C6、C8、C10、C14、C14:2、C16:1、C18:2 的99.5% 上限值：早產組高于正常孕周組；C6DC、C12、C16 的99.5%上限值：早產組低于正常孕周組；C0 的0.5%下限值：早產組高于正常孕周組；瓜氨酸、甲硫氨酸、C16、C18、C18:1 的0.5%下限值：早產組低于正常孕周組。其余酰基肉堿的0.5%下限值與99.5%上限值在兩組間無明顯變化或相差不大。

表2 不同出生胎齡新生兒氨基酸、游離肉堿和酰基肉堿參考區間（μmol/L，P0.5～P99.5）Table 2 Reference ranges of amino acids, free carnitine and acyl carnitine for neonates with different gestational ages（μmol/L,P0.5～P99.5）

2.3 參考區間重設定前后部分質量指標變化情況

對于之前篩查的陽性結果及部分篩查質量指標，用重新設定的參考區間做前后分析，重設定參考區間后，假陽性率在早產組和正常孕周組分別由8.17%、4.86% 下降到3.72%、1.48%，陽性預測值分別由0.56%、1.44%上升到2.17%、3.41%，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 參考區間設定前后部分質量指標對比分析Table 3 Comparison of some quality indexes before and after reference range setting

3 討論

3.1 新生兒遺傳代謝病串聯質譜篩查切值設置的重要性

遺傳代謝病（inherited metabolic diseases，IEM）是由于基因突變引起酶、受體、載體等蛋白活性降低或功能缺陷，導致體內生化物質在合成、代謝、轉運和儲存等方面出現各種異常，造成中間或旁路代謝產物蓄積，或終末代謝產物缺乏，從而導致機體生化代謝紊亂，引起一系列臨床癥狀的一組特殊疾病[6]。串聯質譜檢測技術的運用，使我們能檢測更多的遺傳代謝病，而不恰當、不合理的切值設定可能導致假陰性或者假陽性，造成臨床判讀的偏差[7-8]。國家衛生健康委臨床檢驗中心2017 年室間質量評價（external quality assessment，EQA）計劃臨床判斷值的調查結果顯示，35%的實驗室氨基酸和酰基肉堿臨床判斷值與預期結果不一致。分析原因發現，其中68%的實驗室是由于切值設置不合理造成的[9]。

3.2 早產組和正常孕周組串聯質譜篩查切值分析

早產兒與足月兒體內相關代謝酶成熟度存在差異，血液代謝物水平也有較大差異，檢測結果可能過高或過低，故切值計算需要考慮胎齡因素，提高篩查特異度，盡量避免假陽性或假陰性[10-11]。本研究也發現，11 種氨基酸及C0、C2、C3、C4、C5、C6、C8、C10、C14、C14:2、C16:1、C18:2 的99.5%上限值，早產組高于正常孕周組。C6DC、C12、C16 的99.5%上限值，早產組低于正常孕周組。因為C0 降低提示原發性肉堿缺乏癥，而C0 的0.5%下限值早產組高于正常孕周組，C16、C18 和C18:1 降低提示肉堿棕櫚酰轉移酶Ⅰ缺乏癥，C16、C18、C18:1 的0.5%下限值早產組低于正常孕周組。瓜氨酸降低提示尿素循環障礙相關疾病，甲硫氨酸降低提示甲基丙二酸血癥或同型半胱氨酸血癥，瓜氨酸和甲硫氨酸的0.5%下限值早產組也低于正常孕周組，所以臨床判斷時要考慮胎齡因素，避免假陽性和假陰性。其余酰基肉堿的0.5%下限值與99.5%上限值在兩組間無明顯變化或相差不大。

通過對部分篩查質量指標進行參考區間設定前后的對比分析，發現不管是早產組還是正常孕周組，篩查的假陽性率均明顯下降，陽性預測值均提高，且差異有統計學意義，說明按照不同胎齡對串聯質譜檢測參考區間進行設定，分別進行陽性預判，能大大提高檢測的特異度，降低假陽性率。

3.3 展望

本研究的早產組數據，僅包括32 周≤胎齡＜37周，后續應該對胎齡＜32 周，以及不同出生體重的新生兒串聯質譜篩查數據進行分析，進一步完善陽性切值。隨著實驗數據的不斷增多，也需要定期調整參考區間。也建議各實驗室根據自己區域人群、地區差異、實驗方法的不同而建立適合自己實驗室的串聯質譜檢測參考區間，利用大數據建立早產兒獨立的新生兒篩查的切值[12]，降低假陽性率或假陰性率，提高陽性預測值。