外用紅油膏對大鼠體內汞蓄積及肝腎功能的影響*

葛巍 廖武 張夢婕 楊蘇琴

（江西中醫藥大學附屬醫院 南昌 330006）

紅油膏是由九一丹、東丹按比例配以凡士林調和而成的礦物類中藥外用制劑，具有拔毒祛腐、斂瘡生肌之功效，臨床上多用于肛周膿腫、肛瘺、肛竇炎、乳癰及慢性皮膚潰瘍等膿腐或難愈創面，且療效穩定、確切[1～2]。九一丹作為紅油膏療效的重要來源，其中升丹主要成分為氧化汞（HgO），有研究顯示超劑量、長時間用藥可能導致體內汞蓄積甚至汞中毒，易造成肝腎功能損傷[3]。由于紅油膏在肛腸疾病中的應用范圍較廣且療效確切，但對其毒副作用、用藥劑量及時間的研究鮮有報道。因此，本實驗通過大鼠外用不同劑量紅油膏1個月，并觀察其血液、尿液、肝臟及腎臟中汞含量和肝腎功能，以期為紅油膏臨床安全性提供數據參考。現報道如下：

1 材料

1.1 藥品與試劑 紅油膏粉（煅石膏、升丹、東丹按9:1:1.5比例混合制成），由江西中醫藥大學附屬醫院藥劑科配制；醫用凡士林紗布（國械注準20193141543）；水合氯醛溶液（江西省兒童醫院，批號H20120021）；75%乙醇溶液（江西健寶醫藥科技有限公司，批號20201006）；氯化鈉注射液（國藥準字H10983065）；汞標準液（1 000μg/ml，中國計量科學研究院）。

1.2 儀器 3110全自動生化分析儀（日本HITACHI公司）；RA-915M賽曼原子吸收汞分析儀（北京Lumex分析儀器公司）；5430R小型臺式高速冷凍離心機（Eppendorf艾本德中國有限公司）；ME55型1/10萬電子天平（梅特勒-托利多國際貿易有限公司）。

1.3 動物 SPF級SD大鼠40只，體質量200 g，雌雄各半，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004。置于江西中醫藥大學動物實驗中心分籠飼養，恒溫恒濕，采食全價標準飼料，自由飲水，適應性喂養7 d后開始實驗。動物實驗嚴格遵守江西中醫藥大學實驗動物中心動物倫理委員會要求，批準號：JZLLSC20210024。

2 方法

2.1 不同劑量紅油膏的制備 將煅石膏、升丹、東丹研極細粉，過80目篩，按9:1:1.5比例混合制成紅油膏粉[4]。根據九一丹人體臨床日均劑量為200 mg（上海中醫藥大學附屬龍華醫院提供）[5]，按人與大鼠體表面積換算，人體表面積約1.6 m2（體質量60 kg），則人日均劑量為125 mg/m2；大鼠表面積約0.033 m2（體質量0.2 kg），則大鼠日均劑量為4.125 mg[6]。因此，大鼠紅油膏粉日均劑量為4.744 mg（相當于人體臨床日均劑量230mg）。稱取紅油膏粉4.744 mg、94.875 mg、189.750 mg均勻涂抹于3 cm×3 cm醫用凡士林紗條上，制成低劑量紅油膏紗條（相當于正常劑量）、中劑量紅油膏紗條（相當于正常劑量20倍）、高劑量紅油膏紗條（相當于正常劑量40倍）。

2.2 實驗分組與給藥 將40只大鼠隨機分成4組（正常組、紅油膏低劑量組、紅油膏中劑量組、紅油膏高劑量組），每組10只。按體質量予以10%水合氯醛（0.35 ml/100 g）腹腔注射麻醉后，大鼠背部剃毛，面積約5 cm×5 cm，用橡皮筋捆住四肢，呈腹臥位固定在大鼠固定板上，75%乙醇局部消毒手術區，選擇距肩胛骨以下2 cm，以背中部脊柱為中點制作3 cm×3 cm的全層皮膚缺損創面，深至深筋膜層，形成機械損傷動物模型，每隔3 d用刀片刮傷，保持新鮮、不愈合狀態。給藥前予以氯化鈉注射液清洗創面，正常組予以醫用凡士林紗條貼敷，給藥組分別予以紅油膏低劑量紗條、紅油膏中劑量紗條、紅油膏高劑量紗條貼敷。換藥結束后予紗布覆蓋，膠布固定，每日換藥1次，持續30 d。

2.3 體內汞蓄積測定 持續給藥30 d，第30天收集各組大鼠24 h尿液。給藥結束次日，大鼠麻醉后腹主動脈取全血置于抗凝管，靜置1 h，4℃、3 500 r/min離心10 min，取血清置于EP管；同時摘取肝臟和腎臟制備組織勻漿，4℃、3 500 r/min離心15 min，分離上清液置于EP管。用賽曼原子吸收汞分析儀檢測大鼠尿液、血液、肝臟及腎臟中的汞含量。

2.4 肝腎功能檢測同上述方法制成血清，用全自動生化儀測定大鼠血清中丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）的含量。

2.5 統計學方法數據處理采用SPSS22.0統計學軟件，計數資料以%表示，采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 紅油膏對大鼠血液、尿液、肝臟及腎臟中汞含量的影響持續30 d給藥后，相比正常組，紅油膏低、中、高劑量組的血液和尿液中汞含量均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），且紅油膏中、高劑量組的肝臟、腎臟中汞含量均明顯升高（P＜0.01）。相比紅油膏低劑量組，紅油膏中、高劑量組尿液、肝臟、腎臟中汞含量均明顯升高（P＜0.01）。相比紅油膏中劑量組，紅油膏高劑量組尿液、腎臟中汞含量均明顯升高（P＜0.01）。見表1。

表1 紅油膏對大鼠血液、尿液、肝臟及腎臟中汞含量的影響（x±s）

3.2 紅油膏對大鼠肝腎功能的影響 持續給藥30 d后，在肝功能方面，紅油膏高劑量組中AST含量較正常組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），其余各給藥組中ALT、AST的含量與正常組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。在腎功能方面，相比于正常組，紅油膏中、高劑量組中BUN與CREA含量均明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 紅油膏對大鼠肝腎功能的影響（x±s）

4 討論

中醫丹藥應用起源于春秋戰國，至明清達到鼎盛時期，尤其在中醫外科領域收獲奇效[7]。但其中不乏含有鉛、汞、砷等有毒成分，長期應用時應時刻警惕這些有毒成分蓄積及靶器官毒性反應[8]。除了口服途徑以外，現代研究發現含汞礦物類中藥外用也是造成汞蓄積及慢性肝腎損傷的重要原因，且主要與用藥劑量及時間有關[9]。因此，亟待開展紅油膏外用安全性及毒性研究的動物實驗。

在體內汞蓄積方面，大鼠持續紅油膏給藥30 d后，汞在血液和尿液中存在不同程度的蓄積，隨著用藥劑量的逐漸加大，肝腎臟出現明顯汞蓄積，其中尿液和腎臟的汞蓄積呈一定劑量依賴性。特別注意的是肝臟、腎臟在正常臨床日均用量下汞蓄積量未見明顯差異。上述結果提示正常臨床日均用量下外用紅油膏30 d對肝臟、腎臟汞蓄積影響較小，而過量使用紅油膏是導致肝腎汞蓄積的主要因素。汞在體內代謝周期長，易產生體內蓄積及靶器官毒性反應，有研究顯示小鼠連續2周灌胃朱砂可發現小鼠的肝臟、腎臟、血液均有明顯汞蓄積[10]。體內汞蓄積實驗表明長期給藥的汞蓄積量為腎臟＞腦＞肝臟＞血液，而單次給藥的汞蓄積量為肝臟最多[11]。腎臟作為汞的主要排泄器官，汞蓄積可引發腎臟中半胱氨酸-汞-半胱氨酸耦合物形成、脂質過氧化損傷以及有機陰離子轉運體Oat1和Oat受到抑制，進而導致腎小管上皮細胞腫脹壞死、皮質增厚、腎腫大等腎實質損傷[12]。汞還可與體內靶器官中的谷胱甘肽和谷胱甘肽過氧化物酶等產生結合作用，導致含巰基的抗氧化劑損耗及蛋白質損傷，進而引發氧化應激介導的肝損傷[13]。

對大鼠肝腎功能的相關指標檢測發現，低劑量紅油膏對ALT、AST、BUN、CREA水平影響較小，而高劑量紅油膏可致AST含量明顯升高，中、高劑量紅油膏也可致BUN、CREA含量明顯升高。血清ALT、AST是評價肝功能的重要指標，汞蓄積可誘導脂質過氧化，進而引發ALT、AST等肝功能異常升高[14]。血清BUN、CREA是評價腎小球濾過功能的經典指標，兩者水平升高能夠間接反映腎臟損傷程度[15]。上述實驗結果提示超劑量使用紅油膏可對肝腎功能造成損傷，而持續30 d的正常臨床日均用量未見明顯的肝腎毒性。然而，上述實驗中紅油膏中劑量組中AST含量與肝臟汞蓄積量存在滯后性，這也提示AST在評價汞蓄積所致肝毒性的靈敏度方面可能存在誤差。中、高劑量紅油膏中BUN、CREA含量上升趨勢與腎臟汞蓄積量一致，表明BUN、CREA可能是評價紅油膏汞蓄積所致腎毒性的可靠指標。

綜上所述，紅油膏長期、超量給藥可造成大鼠體內血液、尿液、肝臟、腎臟中汞蓄積及肝臟、腎毒性，但日均劑量4.744 mg（相當于人體臨床日均劑量230 mg）且持續30 d外用紅油膏粉對肝腎臟汞蓄積及肝腎功能影響較小，可為紅油膏臨床安全性提供數據參考。盡管如此，人體臨床日均劑量230 mg紅油膏在血液和尿液中汞蓄積仍不可避免，建議通過減少使用時間以保障紅油膏臨床用藥安全。對于兒童、孕婦、老年人等特殊人群仍然缺乏相關安全性評價證據，建議禁用、慎用。