腫瘤壞死因子α誘導蛋白6在胃癌組織中的表達及其與預后的關系

戚利坤，王巍

胃癌是全球范圍內常見的消化系統惡性腫瘤，其發病率與病死率均居所有惡性腫瘤的前列［1-2］。目前，胃癌患者的5年總體生存率仍不足40%，術后的局部復發或遠處轉移依然是胃癌臨床治療亟待解決的問題［3-4］。尋找胃癌復發轉移相關的生物標志物對于患者的預后預測及后續治療策略的制定具有重要的臨床意義。腫瘤壞死因子α 誘導蛋白（TNFαIP）是由腫瘤壞死因子α（TNF-α）誘導產生的一類透明質酸結合蛋白家族，包括TNFαIP1、TNFαIP3、TNFαIP4、TNFαIP6、TNFαIP8 等［5］。研究發現，這些蛋白參與了包括炎癥反應、免疫應答、細胞增殖、凋亡、細胞黏附等多種生物學進程，在多種疾病的發生、發展中扮演著至關重要的角色［6-7］。有研究發現，TNFαIP6 高表達與炎癥性腸病的活動性及組織損傷程度有關［8-9］。基于腫瘤微環境中炎癥反應與癌癥之間的密切聯系［10］，筆者推測TNFαIP6可能參與了胃癌的發生發展過程。本研究通過免疫組化染色觀察TNFαIP6蛋白在胃癌組織中的表達情況，分析TNFαIP6 表達與胃癌患者臨床病理特征及預后的關系，旨在揭示其在胃癌轉移中的作用及對預后的預測價值，為胃癌的分子靶向治療提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2015 年6 月—2019 年1 月青海省腫瘤醫院收治并行手術治療的133例胃癌患者作為研究對象。所有患者術后經組織病理學證實為原發性胃腺癌，術前未行任何治療。收集患者術后的組織標本，腫瘤組織于癌中心部位取材，癌旁組織取胃癌組織周邊5 cm以外的正常胃黏膜。收集胃癌患者的一般資料及臨床病理特征，包括年齡、性別、腫瘤直徑、組織學分化類型、Borrmann 分型、腫瘤TNM 分期、血管侵犯、神經浸潤。本研究的設計與實施經本院倫理委員會批準，所有患者均簽署告知同意書，明確手術標本的使用目的。

1.2 免疫組化染色檢測TNFαIP6 表達 將胃癌組織標本連續切片制成4μm厚度的組織薄片，依次進行脫蠟、梯度乙醇脫水、抗原修復及去除內源性過氧化物酶。切片使用山羊血清封閉后，加入兔抗人TNFαIP6 單克隆抗體（1∶200，購自美國Santa Cruz）于4 ℃下孵育過夜；次日使用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗切片3 次，二抗孵育后進行DAB 顯色，蘇木素復染，顯微鏡下觀察染色強度及染色細胞的比例。隨機讀取4個高倍視野，以染色陰性或染色不清為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；同時，計數200個細胞，計算陽性細胞百分比，染色陽性細胞百分比＜5%計0 分，5%~25%計1 分，26%~50%計2 分，51%~75%計3 分，＞75%計4 分。TNFαIP6 在胃癌組織中的免疫組化評分基于染色強度與染色細胞比例得分的乘積，總分＜4 分為低表達，≥4 分為高表達。

1.3 隨訪 所有患者于術后定期至我院門診進行復查，具體項目包括：血清腫瘤標志物測定及胸、腹、盆腔CT 檢查，每3個月1 次；胃鏡，每年1 次，以監測腫瘤的復發與轉移。術后隨訪通過電話及查閱病歷等方式進行，末次隨訪時間為2020年7月，全部病例無失訪，中位隨訪時間為45.3個月（2~61個月）。本研究的主要終點事件為總體生存期（overall survival，OS），即自手術之日起至末次隨訪或因任何原因死亡的時間。

1.4 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行數據分析。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示；計數資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier 法繪制TNFαIP6 高表達與低表達患者的生存曲線，2 組患者的生存率差異采用Log-rank檢驗。采用Cox風險比例回歸模型評估胃癌患者預后的影響因素。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者臨床病理情況 133例患者中男83例（62.4%），女50例（37.6%）；患者年齡34~90歲，平均（63.7±10.1）歲；中高分化腺癌69例，低分化腺癌64例；T1~T2 期71例，T3~T4 期62例；64例（48.1%）存在淋巴結轉移，9例（6.8%）在診斷時已存在遠處轉移；血管侵犯與神經浸潤的發生率分別為54.1%（72∕133）和16.5%（22∕133）。

2.2 不同臨床特征患者的TNFαIP6 表達水平比較 免疫組化染色結果顯示，TNFαIP6 在胃癌組織中呈明顯陽性表達，以胞漿表達為主，呈彌漫性分布，而在癌旁組織中則多呈陰性表達或弱陽性表達，見圖1。基于免疫組化染色評分，133例患者中TNFαIP6 低表達81例，高表達52例。低分化腺癌、Borrmann Ⅳ型、T3~T4期、M1期、血管侵犯及淋巴結轉移者TNFαIP6高表達的比例更高，見表1。

Fig.1 The expression of TNFαIP6 in gastric cancer and adjacent normal tissues detected by immunohistochemistry(×400)圖1 免疫組化檢測TNFαIP6在胃癌及癌旁組織中的表達（×400）

2.3 不同TNFαIP6 表達水平患者的生存分析結果 隨訪期內，共31例患者死亡，Kaplan-Meier 生存曲線顯示，TNFαIP6 高表達與低表達患者5 年總生存率分別為56.5%和82.9%，差異有統計學意義（Log-rankχ2=12.404，P＜0.01），見圖2。

2.4 胃癌患者預后的影響因素分析 單因素Cox回歸分析結果顯示，腫瘤直徑、Borrmann Ⅳ型、T分期、N分期、M分期、血管侵犯、神經浸潤及TNFαIP6表達情況均為胃癌患者預后的影響因素，見表2。選取T分期、M 分期、TNFαIP6 表達情況納入多因素Cox 回歸分析，結果表明T3～T4期、M1期及TNFαIP6高表達是胃癌患者死亡的危險因素，見表3。

Tab.1 Comparison of TNFαIP6 high expression ratio in gastric cancer patients between different clinicopathological characteristics表1 不同臨床病理特征的胃癌患者TNFαIP6高表達比例比較 ［例（%）］

3 討論

腫瘤術后的復發與轉移是胃癌患者預后不佳的主要原因，尋找、認定胃癌患者預后相關的分子標志物對于揭示腫瘤發生發展的具體機制具有重要的意義。本研究通過免疫組化染色發現，與癌旁組織相比，TNFαIP6 在胃癌組織中呈明顯陽性表達，且TNFαIP6高表達與胃癌一系列侵襲性的臨床病理特征如低分化腺癌、Borrmann Ⅳ彌漫型胃癌、更深的腫瘤浸潤、淋巴結轉移、淋巴血管侵犯及遠處轉移有關，提示TNFαIP6 可能參與了胃癌的發生與進展。生存分析及回歸分析進一步表明，TNFαIP6 高表達患者生存時間縮短，高表達者死亡風險是低表達者的2.742倍，提示患者預后不佳。

Fig.2 The Kaplan-Meier curves of patients with high and low expression levels of TNFαIP6圖2 TNFαIP6高表達與低表達患者的生存曲線

Tab.2 Univariate Cox regression analysis on prognosis of gastric cancer patients表2 影響胃癌患者預后的單因素Cox回歸分析

Tab.3 The multivariate Cox regression analysis identified independent predictors of the prognosis of gastric cancer patients表3 影響胃癌患者預后的多因素Cox回歸分析

TNFAIP6 基因位于人類染色體2q23.3，TNFαIP主要分布于細胞外，是一類由TNF-α、干擾素γ、白細胞介素-1 等炎性細胞因子誘導產生的炎癥相關蛋白［6，11］。既往研究發現，TNFαIP6在包括炎癥性腸病［8］、風濕性性關節炎［12］等多種炎性疾病中呈明顯異常表達。近年一些研究報道了TNFαIP6在實體腫瘤中的致癌作用，進一步揭示了腫瘤微環境中的炎性細胞、炎癥因子及信號分子與惡性腫瘤侵襲和轉移的關系。Chan 等［13］研究發現，TNFαIP6 蛋白在尿路上皮癌中呈明顯陽性表達，其高表達與進展的腫瘤分期、淋巴結轉移、神經浸潤、血管侵犯及高有絲分裂率顯著相關，是尿路上皮癌患者不良預后的獨立預測因素。Rachidi 等［14-15］報道TNFαIP6 蛋白在結腸癌、卵巢癌組織中的表達較癌旁正常組織明顯升高，是患者預后不良的標志。這些研究結果說明TNFαIP6 可能在惡性腫瘤的發生、發展過程中起重要作用，而檢測TNFαIP6 的表達可能有助于腫瘤患者的預后評估及治療策略的制定。目前越來越多的證據表明，進展期胃癌患者可以從術后的輔助化療中獲益，降低復發轉移，改善長期生存結局［16-17］。本研究結果揭示，低分化腺癌、Borrmann Ⅳ型胃癌、T3~T4期腫瘤、淋巴結轉移、血管侵犯者TNFαIP6高表達的比例更高。同時，TNFαIP6 高表達患者也更易發生遠隔器官轉移，預后更差。對于TNFαIP6 高表達的胃癌患者，更加積極的輔助治療與密切的術后隨訪策略必不可少。

目前，已有多項研究證實，慢性炎癥反應在多種惡性腫瘤的發生發展中扮演著至關重要的角色［18-20］。作為一種炎癥相關因子，TNFαIP6 可能通過激活炎癥細胞，募集炎癥信號分子參與了腫瘤相關炎癥反應，進而促進了腫瘤細胞的侵襲與轉移。近 期Zhang 等［21］發 現，下 調 人 胃 癌 細 胞AGS 與MKN28中TNFAIP6表達能夠顯著抑制細胞增殖、侵襲與遷移能力，揭示了TNFAIP6 基因對胃癌細胞惡性生物學行為的作用。然而，到目前為止，關于TNFAIP6基因影響胃癌細胞增殖、侵襲、遷移的具體分子機制仍然沒有被闡明。

綜上，TNFαIP6 在胃癌組織中的陽性表達與腫瘤的侵襲性特征顯著相關，是影響胃癌患者預后的一個獨立預測標志物。TNFαIP6可能作為癌基因參與胃癌的發生與進展，其對胃癌生物學行為的影響及可能涉及的分子機制需要進一步研究探索。