格列本脲對糖尿病大鼠心房重構及心房顫動誘發的影響

霍寧，詹曉萍，周夢竹，張躍，梁雪，李廣平，劉長樂

心房顫動（AF）是臨床中最常見的心律失常之一［1］。近幾年AF發生率不斷增高，75歲以上人群可達10%，且與冠心病、高血壓、腦卒中和心力衰竭等疾病存在密切關系［2-3］。促進AF 發生的機制眾多，如心臟炎癥反應、氧化應激、心肌纖維化等。其中心肌纖維化是無法逆轉的，使得AF 治療更加困難［4］。糖尿病（DM）是AF 發病的獨立危險因素［5］，可改變心房肌細胞的排列順序，使間質纖維化增多，心房肌細胞內徑增大，引發電重構與結構重構，促使AF 發生［6］。格列本脲（GLB）是一種經典的磺酰脲類降糖藥，適用于通過單純飲食控制未能達到理想血糖水平的輕、中度2 型糖尿病患者［7］。除具有降糖作用外，GLB 在呼吸系統、消化系統、泌尿系統等疾病中也起到抑制炎癥反應與氧化應激，減少組織纖維化的作用［8-10］。但GLB與心肌組織纖維化的相關研究較少，本研究旨在探索GLB 是否可以抑制DM 動物模型心肌組織纖維化的產生以及對AF 誘發率的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 檸檬酸鈉緩沖液、鏈脲佐菌素、Masson 染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；血糖試紙條、血糖儀購于三諾生物傳感股份有限公司；GLB（2.5 mg×100 片）購于天津太平洋制藥有限公司；電子體重秤購于北京電子儀器公司；小動物心臟彩色超聲儀購于美國Visual Sonics公司；心內電生理刺激器∕放大器（STG3008-FA）購于澳大利亞ADInstruments 公司；心外膜激活映射標測系統購于英國MappingLab 公司；TP1020全自動生物組織脫水機、病理石蠟切片機、石蠟切片展片機、病理組織烤片機購于德國Leica公司；生物組織包埋機（BMJ-1）購于上海珂淮有限公司，無創血壓計購于Softron biotechnology公司。

1.2 實驗動物及分組 SPF級雄性SD大鼠購于北京華阜康生物科技股份有限公司。將48只體質量200~220 g的健康成年雄性SD大鼠按隨機數字表法分為3組：對照組（Ctl組）、糖尿病組（DM組）和糖尿病+格列本脲組（GLB組），每組16只。每組按隨機數字表法抽取8只進行心臟超聲檢查，隨后行無創血壓檢測并留取心臟組織進行組織病理實驗，另8只行在體心臟電生理實驗以及心外膜激活映射標測。

1.3 DM動物模型建立 造模前大鼠禁食12 h。將鏈脲佐菌素溶解于檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol∕L，pH=4.5）中配成鏈脲佐菌素溶液并使用0.22μm 一次性過濾器充分過濾雜質2 遍，以55 mg∕kg 的劑量經腹腔快速注射入大鼠體內。藥物注射后3 d及7 d測量大鼠空腹血糖（禁食12 h，不禁水），2次空腹血糖均≥11 mmol∕L或單次≥14 mmol∕L視為DM大鼠模型建立成功。如實驗動物空腹血糖未達到上述標準，則以55 mg∕kg劑量追加鏈脲佐菌素1次；如追加藥物后實驗動物空腹血糖仍未達到上述標準則剔除實驗。造模成功當日，對GLB組大鼠以10 mg∕kg（將GLB研磨成粉末狀，加入蒸餾水混合）劑量GLB 灌胃。將各組大鼠置于相同環境下飼養6 周，記錄第6周空腹血糖及體質量。

1.4 心臟超聲檢查 造模成功6周后，剪去動物前胸及四肢末端體毛，連接體表心電圖并行經胸二維超聲心動圖檢查。應用高分辨率小動物超聲，心尖四腔切面測量二尖瓣血流頻譜舒張早期波峰值速度（E）、舒張晚期波峰值速度（A），于左心室長軸及短軸觀測左心房內徑、左心室射血分數、左心室短軸縮短率、E∕A、肺動脈血流加速時間、平均肺動脈壓、收縮與舒張期室間隔、左心室內徑和左心室后壁厚度。共測量3次。

1.5 無創血壓檢測 心臟超聲檢查結束后，對大鼠進行無創血壓檢測。提前將大鼠放于室內保持安靜以適應環境，待穩定后，固定大鼠并對尾巴進行加溫使血管擴張，利于檢測，大鼠穩定10 min 后測定心率、收縮壓和舒張壓，計算平均動脈壓，共進行3次測量，每次間隔20 s。

1.6 組織病理學檢測 完成無創血壓測定后，開胸取大鼠心臟置于4 ℃PBS 緩沖液中，擠去殘血并剪除多余組織，稱取心臟總質量后將心房肌組織用于組織病理學實驗。將組織放于10%中性福爾馬林液中固定10~14 d，經乙醇梯度脫水后用石蠟包埋并切片，行Masson 染色。每只動物取Masson染色切片在400 倍視野下隨機讀取5 個視野的圖像存入電腦，后使用Image J v1.8.0軟件測量膠原總面積及圖像組織總面積，計算膠原容積分數（CVF）。

1.7 在體電生理實驗以及心外膜激活映射標測 造模成功6 周后，將各組動物用3%三溴乙醇溶液（150 mg∕kg）全身麻醉，剪開頸部皮膚，將右側頸靜脈分離，結扎頸靜脈后插入電極導絲進行房室文氏周長、竇房結恢復時間、有效不應期、AF誘發率的檢測（每只大鼠行15次刺激，每組合計誘發總次數為120 次；AF 誘發率=誘發成功次數∕誘發總次數×100%）。之后游離氣管進行氣管插管，連接小動物呼吸機后開胸行心外膜激活映射標測，將記錄電極陣列（6格×6格）置于心臟表面，記錄絕對不均勻指數與傳導相對異質性、心外膜傳導速度。

1.8 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行Tukey檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間多重比較采用Dunn's（經Bonferron 法校正）檢驗；計數資料采用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 6 周時基本特征及心臟超聲指標比較 與Ctl組相比，DM組的心臟體質量比、心房體質量比、心室體質量比、血糖水平、E∕A比值、左心房內徑均增加，體質量、心率、舒張期左心室后壁厚度、收縮期左心室后壁厚度和舒張期室間隔厚度均降低（P＜0.05）；與DM組相比，GLB組的心臟體質量比降低，左心房內徑減小。余指標差異無統計學意義，見表1。

2.2 在體心外膜激活映射標測比較 DM 組較Ctl組心外膜傳導速度降低，傳導相對異質性增加；與DM組相比，GLB組心外膜傳導速度提高（P＜0.05），傳導相對異質性差異無統計學意義，見圖1、表2。

2.3 心房肌病理比較 Ctl組、DM組和GLB組CVF（%）分別為0.97±0.40、7.54±1.11 和3.73±1.06，3 組差異有統計學意義（F=90.711，P＜0.01）；GLB組和DM組較Ctl 組心房肌纖維化程度加重，CVF 增大（P＜0.05）。GLB 組較DM 組心房肌纖維化程度減輕，CVF減小（P＜0.05）。見圖2。

2.4 在體電生理結果比較 在體電生理學研究表明，與Ctl 組相比，DM 組的R-R 間期、文式周長、有效不應期延長，AF 誘發率升高（P＜0.05）；GLB 組較DM 組R-R 間期縮短，AF 誘發率下降（P＜0.05）。3組間竇房結恢復時間差異無統計學意義。見表3。

Fig.1 The mapping results of rat epicardial activation between the three groups圖1 3組大鼠心外膜激活映射標測結果

Fig.2 Pathological results of atrial muscle in three groups of rats（Masson dyeing,×400）圖2 3組大鼠的心房肌病理結果（Masson染色，×400）

Tab.2 Comparison of epicardial activation mapping of rats between the three groups表2 3組大鼠心外膜激活映射標測結果比較（n=8，±s）

Tab.2 Comparison of epicardial activation mapping of rats between the three groups表2 3組大鼠心外膜激活映射標測結果比較（n=8，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與Ctl組比較，b與DM組比較，P＜0.05。

組別Ctl組DM組GLB組F心外膜傳導速度（m∕s）0.73±0.05 0.52±0.11a 0.70±0.12b 9.126＊＊絕對不均勻指數2.80±0.34 3.11±0.83 2.86±0.29 0.641傳導相對異質性1.44±0.34 2.11±0.53a 1.62±0.35 4.762＊

3 討論

研究表明，DM 促進AF 發生涉及多種因素。隨著疾病進展，DM 患者AF 的發生率增高［11］。DM 動物模型的氧化應激與炎癥反應可引起心肌細胞以及結締組織重新排列［12］；高血糖可刺激心臟成纖維細胞增殖，使神經體液級聯反應與氧化應激增強，這些反應均會導致組織纖維化程度加重。糖基化終產物是指氨基酸、脂類或核酸等大分子物質的游離氨基與還原糖的醛基經過一系列化學反應后產生的終末產物。在高糖狀態刺激下，糖基化終產物逐漸積累，促進組織增生肥大且加重纖維化，加強其炎癥反應［13］，最終導致心臟發生電重構與結構重構，電位活動發生異常，AF發生率增高。本研究以心臟超聲指標與病理染色評估心臟結構重構，在體心外膜激活映射標測與在體電生理實驗評估心臟電重構。

Zhan 等［14］研究發現經注射血管緊張素Ⅱ的小鼠服用一種日本植物藥rikkunshito 后，心房纖維化程度較對照組減輕，AF誘發率下降。本實驗研究結果與上述結果相似，DM 組心房肌纖維化程度比Ctl組明顯加重，經過GLB 治療的DM 大鼠心房肌纖維化程度減輕，AF誘發率下降。心臟體質量比是反映心臟肥厚的有效指標。Qin 等［15］發現心臟肥厚的小鼠心臟體質量比顯著大于正常小鼠。本研究DM組大鼠心臟體質量比、心房體質量比和心室體質量比均顯著大于Ctl組，其中心臟體質量比與心室體質量比在GLB 組中得到顯著改善。DM動物模型中左心房內徑顯著擴大［16］。左心房內徑可作為導管射頻消融術患者AF 復發的重要預測因子，與AF 發生率關系密切［17］。有研究納入3 750例環肺靜脈隔離術的患者，發現左心房擴張可顯著增加術后AF復發的風險［18］。研究發現飲酒者心房內徑可以伴隨乙醇攝入量增加而增大，AF 發生率也隨之提高［19］。本研究DM 大鼠在高血糖刺激下左心房內徑增大，AF 誘發率上升，與既往研究結果一致，經GLB 治療后，左心房內徑減小，AF 誘發率顯著下降。近期有研究表明，與左心房內徑相比，左心房球形度是預測AF 發生更加敏感的指標［20］，DM 對于動物左心房球形度改變的影響以及是否可作為AF 發生的預測指標有待進一步研究。

Tab.3 Electrophysiological results of the three groups of rats表3 3組大鼠電生理結果 （n=8）

DM對于心臟電活動有較大影響，高血糖狀態下心肌纖維化程度加重，炎癥反應與氧化應激刺激可導致心肌動作電位時間延長，電位幅度減小，復極離散度增大［21］。Gong 等［22］研究表明，DM 可顯著降低大鼠的心外膜傳導速度，增加絕對不均勻指數與傳導相對異質性。本研究中DM 組大鼠較Ctl 組大鼠傳導相對異質性顯著增大，心外膜傳導速度顯著降低，經GLB治療后可提高心外膜傳導速度，但3組動物模型中絕對不均勻指數差異無統計學意義。Karam 等［12］發現DM 患者有效不應期較正常人群縮短。但相關研究表明DM動物模型有效不應期較正常組延長［23-24］，與本研究結果一致，具體機制仍需進一步探究。

Spallone 等［25］發現DM 患者由于迷走神經功能損害以及交感神經敏感性增加，心率可高于非DM人群。本實驗中DM 組與GLB 組心率低于Ctl 組。筆者分析認為可能由于此次造模時間較短，自主神經功能未受明顯影響，下一步可以延長造模時間，探究大鼠DM 狀態對自主神經功能的影響。Diwan等［8］發現GLB在可以改善慢性腎臟病大鼠腎臟結構并減少纖維化，且經GLB 治療的大鼠收縮壓得到改善，但并未發現對心臟纖維化的作用。本研究中GLB 組大鼠心房肌組織纖維化明顯改善，但未發現對血壓有影響，分析可能由于動物模型不同，本研究中3組大鼠的血壓均處于正常范圍［26］。

綜上所述，本研究發現DM 可以提高大鼠的AF誘發率，GLB 通過改變其電重構與結構重構降低其AF 誘發率。今后將從基因、蛋白水平進一步探究GLB 在DM動物模型中改善心房電重構與結構重構以及降低AF誘發率的具體機制。