豬圓環病毒2d 型滅活苗臨床免疫效果評價

肖 敏 ，劉 建 ，盧 昌 ，曹華斌 ，王 闖 *

（1.江西正邦養殖有限公司，江西 南昌 330096；2.江西正邦農業科學院，江西 南昌 330096；3.江西農業大學，江西 南昌 330045）

豬圓環病毒2 型（Porcine circovirus type-2，PCV2）是仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的病原體。PCV2 在各個國家和地區都普遍存在，且各個階段的豬群均表現出極強的易感性。PCV2 感染后主要是侵害豬的免疫系統，使機體處于免疫抑制狀態，從而繼發感染其他病原微生物，嚴重影響養豬業的經濟發展。PCV2 的危害性并不只是針對于該病毒，而是因主要表現在它與豬副嗜血桿菌、豬鏈球菌、豬肺炎支原體、豬藍耳病病毒以及豬細小病毒等的繼發感染。

根據PCV2 基因序列的差異，可將其分為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d 和PCV2e 五個亞型。Wei 等在2011-2012 對華南大區分離的66 株PCV2 進行基因分析，結果顯示其中45 株為PCV2d型，占比68.2%。2013-2015 年，Zhan 等對中國南部地區的62 株PCV2 分離株進行基因比對，結果發現PCV2d 型高達72.6%。Qu 等在2012-2016 年在湖南地區的流行病學調查中發現，在PCV2 陽性樣本中PCV2d 的感染率為67%。這些表明，在我國PCV2d 已日漸成為主要的流行毒株。GUO 等用PCV2a、PCV2b 和PCV2d 三個毒株分別給30 日齡健康仔豬進行攻毒，結果發現PCV2d 攻毒組在病變臟器中的核酸拷貝數高于PCV2a 和PCV2b 組，表明PCV2d 的毒力強于PCV2a 和PCV2b，目前，我國大部分豬場都是PCV2 陽性場，并且很難凈化，也沒有可以治療的特效藥。因此，對于圓環病毒的防控主要還是依靠疫苗免疫。滅活苗的穩定性好，安全性高，目前市場上應用最廣的還是圓環病毒滅活苗。

本研究采用PCV2 的2d 型毒株制備了PCV2 滅活苗，通過免疫35 日齡仔豬，利用血清抗體和抗原陽性率等指標評價其免疫效果。

1 材料與方法

1.1 病毒與細胞

病毒為江西正邦農業科學院動物保健研究所從湖北黃岡某豬場的陽性病料中分離，經測序分析為PCV2d 型，命名為HB/ZB 株，經測 定TCID50為107.0/mL；PK15 細胞，購自美國模式培養物集存庫（American type culture collection，ATCC）。

1.2 主要試劑與試驗動物

ISA206 佐劑，購自法國賽比克；DNA 提取試劑盒，購自金瑞鴻捷生物科技有限公司；豬圓環病毒2 型ELISA 抗體檢測試劑盒（批號：B20181214），購自韓國金諾；商品苗A、B（均為2b 型毒株滅活苗）為國藥動保和貴州福斯特公司生產。120 頭21 日齡健康仔豬，集團規模化養殖場自養。

1.3 滅活疫苗的制備與檢驗

按 1∶2 000 比例向病毒液中緩慢加入β-丙內酯，邊加邊攪拌，然后在4℃條件下攪拌滅活48 h，再置于37℃水浴2 h。取滅活病毒液與PK15 克隆細胞懸液（細胞濃度為2×105個/mL）按1∶9 混合，接種于25 cm2的細胞培養瓶。同時設置病毒陽性對照，盲傳3 代，采用間接免疫熒光法進行滅活檢驗。

將檢驗合格的滅活病毒液置于乳化容器中，按水相與油佐劑3∶1 的比例緩慢加入ISA206 佐劑，邊加邊攪拌，然后以800 r/min 攪 拌30 min，制 成水包油型疫苗。對成品苗進行無菌和物理性狀的檢驗，按照現行的《中國獸藥典》附錄進行無菌檢驗。

1.4 對仔豬的免疫效果評價

將120 頭21 日齡仔豬，隨機分成4組，每組30頭。分別為試驗組，商品苗A 組，商品苗B 組，對照組。試驗組每頭仔豬頸部肌肉注射2 mL對應疫苗，對照組注射2 mL 生理鹽水。分別于免疫后7 d、14 d、21 d、35 d、105 d 采集血清。免疫后35 d、105 d 稱體重，記錄死亡數，統計成活率。

免疫后21 d、105 d 血清中核酸數量的檢測采用實時熒光定量PCR（qPCR）法。根據Genbank 中已知的PCV2 基因序列設計引物，引物序列為F：CCAGGAGGGCGTTCTGACT，R：CGTTACCGCTGGAGAAGGAA，引物由華大基因合成。擴增體系 為20 μL：TB Green Premix DimerEraser（2X）10 μL，ROX Reference Dye（50X）0.4 μL，上、下游引物各（10 μmol/L）0.6 μL，模板2 μL，滅菌水6.4 μL。標準品為本實驗室制備并經過驗證。反應程序為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，55℃ 30 s，72℃ 34 s，40 個循環。

血清中抗體水平的檢測采用間接ELISA 法，嚴格按照試劑盒步驟進行檢測。

1.5 統計與分析

本試驗數據采用SPSS 22.0 軟件，對各組間數據通過單因素方差分析（One-Way ANOVA），抗原與抗體陽性率比較采用卡方檢驗。

2 結果與分析

2.1 疫苗的檢驗

在熒光顯微鏡下未觀察到熒光，表明滅活徹底。外觀檢驗為乳白色，穩定性試驗：800×g 離心15 min 未出現破乳現象。無菌檢驗時無菌落形成，無菌檢驗合格。

2.2 對仔豬的免疫效果評價

2.2.1 疫苗對體重及成活率的影響

免疫105 d 后試驗組存活率為93%，商品苗A 組和商品苗B 組的存活率分別為95%、93%，未免疫對照組的存活率為70%。試驗組與商品苗組的存活率都高于對照組。由表1 可以看出，免疫前各組體重無顯著性差異（P＞0.05），免疫35 d、105 d 后試驗組與商品苗的2 個組的增重均顯著高于對照組（P＜0.05）。

表1 免疫35 d、105 d 后各組體重 kg/頭

2.2.2 疫苗對仔豬血液病毒載量的影響

免疫后21 d 各組血清抗原檢測均為陰性。由表2 可以看出，免疫后105 d 試驗組與2 個商品苗組抗原含量與抗原陽性率顯著低于陰性的對照組（P＜0.05），且試驗組的抗原陽性率又顯著低于兩個商品苗組（P＜0.05）。

表2 免疫105 d 后各組抗原含量和抗原陽性率

2.2.3 疫苗對仔豬抗體水平的影響

免疫前后不同日齡各組血清抗體水平見圖1，免疫前后各組血清抗體陽性率見表3。從圖1 和表3 可以看出，免疫前各組抗體水平較高，且抗體陽性率100%，表明該豬群母源抗體水平較好。免疫后35 d 各組的抗體水平持續下降并到達最低點，但此時試驗組仍能維持較高的陽性率，且抗體水平高于其余3 組。免疫后105 d，各組抗體全部升高，各組間差異不顯著（P＞0.05）。

圖1 免疫前后不同日齡各組血清抗體水平

表3 免疫前后各組血清抗體陽性率

3 討論

2014-2015 年翟寶庫等對大慶周邊的未免疫豬群進行了血清學調查，結果顯示豬群PCV2 的感染率為54.7%。時慶賀等對2016-2017 年 對13 份PCV2 陽性樣品進行測序分析，其中7 株為2b 型，6 株為2d 型。吳明臻等對浙江金華地區2012-2018 年的PCV2 進行了分子流行病學調查，未發現PCV2c型 和PCV2e 型，PCV2a 和PCV2b均為13.04%，PCV2d 型占73.91%。表明流行毒株在逐漸向2d 型過渡。因此本研究選用本實驗室分離的2d型毒株HB/ZB 株來制備滅活苗，對于豬群抵抗PCV2 感染提供更好的保護作用。

本研究中的免疫組的仔豬均增重顯著高于對照組，這與莊汝柏、周華林等的研究結果一致。PCV2 感染常導致豬皮炎與腎病綜合征、滲出性皮炎、先天性震顫和腸炎、肉芽腫性腸炎、生殖障礙、豬呼吸道疾病綜合征，亞臨床型感染的特點是生長性能不良。本研究中研制的滅活苗能顯著地提高仔豬的均增重，表明該疫苗對有效改善PCV2 的亞臨床感染方面有良好的效果。

翟寶庫等研究發現，仔豬僅免疫1 針PCV2 疫苗，抗體水平并不能達到理想效果，需在首免后2～4 周再進行1 次加強免疫才能獲得更好的保護力。吳忻等選擇抗體陰性的14 日齡仔豬進行免疫，在免疫后6 周抗體陽性率才達到100%，仔豬存在較長時間的抗體空檔期。這與本研究中仔豬育肥前期抗體陽性率100%，抗原全陰性的結果一致。本研究中在免疫后35 d 對照組與2 個商品苗組雖然抗體水平維持在臨界水平以上，但是抗體陽性率都低于80%，表明在育肥后期，這些豬對于PCV2 的感染已經不具備足夠的保護力。這個結論在抗原檢測上也得到了證實，免疫后105 d 各組抗原陽性率開始急劇升高。因此有必要在6 周齡以前再進行1 次加強免疫。