模擬體內環境下血栓形成及藥物溶栓作用

任莉莉 張勝海 程昆木 楊凌鑒 黃九林

摘 要：研究應用芯片灌注模型成功模擬體內環境分析不同管徑對血栓形成和溶解的影響，并通過熒光顯微鏡實時檢測了溶栓藥物對血栓溶解的作用。通過對比研究，發現血栓容易在細小管道內生成，且溶栓所需時間較長。兩種不同溶栓藥物納豆激酶（NK）和蚓激酶（LK）對血栓的溶解情況有明顯不同，在相同管徑和流速條件下，NK和LK質量濃度均為2.5 mg/mL時溶解血栓時間分別為21、12 min;高質量濃度藥物溶解血栓速度更快，且LK作用效果比NK較為顯著。通過熒光標記，LK可同時減少纖維蛋白原和纖維蛋白，從而高效溶解血栓。

關鍵詞：納豆激酶;蚓激酶;微流控芯片;血栓形成;血栓溶解

中圖分類號：R965.1 文獻標識碼：A文章編號：1001-5922（2022）02-0001-05

血栓栓塞性疾病（Thromboembolic disease，TD）涉及心血管、腎臟科、神經內科、外科、骨科、腫瘤等多個領域，在很多方面影響著人體健康。纖維蛋白聚合成網狀后和血小板一起形成能夠止血的凝塊，同時也可以生成病理性血管栓塞[1]。體內纖維蛋白凝固和溶解系統是互相協調的，用來保持血栓形成和溶解之間的平衡。一旦平衡打破，病理狀況就會發生。纖維蛋白原是纖維蛋白的前體物質，由兩個相同亞單位組成，包含3個多肽鏈。在凝血酶的作用下，纖維蛋白原轉變為纖維蛋白，再通過聚合作用形成纖維蛋白凝塊。從而引起心肌梗塞、血管栓塞等疾病。纖維蛋白原的活化也與炎癥、腫瘤生長和其他疾病有關[2-3]。

降解纖維蛋白是一個重要的治療血管栓塞性疾病的方法。纖維蛋白溶酶可以直接水解纖維蛋白。其中納豆激酶（Nattokinase，NK）是從傳統食品納豆、豆豉中提取出來的，有纖溶酶原激活作用，也可以直接溶解纖維蛋白。納豆激酶的纖維蛋白溶解活性可以在血液中持續3 h[4-5]。蚓激酶（Lumbrukinase，LK）是從蚯蚓中提取的一種絲氨酸蛋白酶，具有很強的溶解纖維蛋白和血栓的能力[6-7]。這兩種酶來源豐富、安全有效，是很有潛力的溶栓藥物。很多體外血栓形成和溶解實驗是在封閉的攪拌條件、培養皿或修飾的流動小室進行的[1，8-9]。為了更好地建立一個體外研究血栓栓塞性疾病的模型，本研究用聚二甲基硅氧烷（PDMS）制備微流控芯片，膠原蛋白修飾管道，模擬人體內微動脈血管[10-12]，用少量的血樣和凝血酶在芯片管道內形成血栓。在流動條件下，用熒光顯微鏡觀察血栓在不同管道形成情況及其在NK和LK作用下的溶解過程，為體外研究血栓栓塞性疾病的治療提供更為有效的方法。

1 結果與討論

1.1 血栓形成分析

本研究制備了不同管徑的微流控芯片反應區（見圖1），模擬不同直徑血管，芯片管徑高均為35 μm，寬分別為300、200和100 μm。其中一個操作區示意圖放大后可以看到兩個入口處分別加入血漿和凝血酶，溶解血栓時為溶栓藥物的進口;波浪處有助于溶液充分混合;可利用顯微鏡在檢測區進行觀察;剩余反應液由出口流出。進口和出口處連接帶有醫用級聚乙烯管的不銹鋼管，連接注射泵進行液體的灌注。

連續注射血漿和凝血酶（10 min）形成血栓，各個管徑內血栓的生成情況如圖2所示。在灌注過程中，凝血酶激活纖維蛋白原發生凝集反應，血小板聚集，纖維狀物質出現。隨著持續的注射血漿和凝血酶，上述過程不斷循環，血栓變的更多更大。在同樣的注射條件下，100 μm的管道內液體流動受到的阻力相對較大，當一處有纖維蛋白覆蓋時，凝塊很容易快速生長，堵塞管道（見圖2（a）示），且這樣的部位有多處。300 μm的管徑中液體流動受到的阻力較小，沒有大的血栓生成，形成的血栓小而松散（見圖2（c）示）。200 μm管徑內的血栓形成情況介于前兩者之間（圖2（b）示）。從實驗結果可以看出，血栓容易在細小管道內生成，即血栓栓塞易發生在微血管中。該方法模擬血管內血栓形成的可行性較好。

1.2 血栓溶解結果

1.2.1 不同管徑對血栓溶解的影響

當向不同管徑的芯片中以1.5 μL/min的流速注入溶栓藥物NK和LK（1.5 mg/mL）時，從表1可以看出，隨著芯片管徑的增大，血栓溶解需要的時間越少;不同管徑內血栓溶解情況基本一致，LK的溶栓時間均少于NK，且LK溶栓效果優于NK;100 μm管徑中的血栓溶解時間最長。在同樣的注射條件下，100 μm的管道內血栓較多且密度較大，有的地方甚至被堵塞，藥物流動時受到的阻力較大，溶解時也需要較長的時間。300 μm的管徑中血栓小而松散，液體受到的阻力較小，溶解時所需時間較少。200 μm管徑內的血栓溶解情況則介于前兩者之間。結合不同管徑血栓形成情況，以200 μm管徑模型進行后續實驗。

1.2.2 不同濃度藥物對血栓溶解的影響

溶栓酶的濃度越高，血栓溶解需要的時間越少;同一濃度下，血栓在藥物作用下隨著時間的增加逐漸減少，這一規律在兩種藥物中均適應。2.5 mg/mL的NK和LK溶解血栓時間分別為21 min和12 min;0.5 mg/mL的NK和LK溶解時間則分別為60 min和39 min（見圖3）。在相同條件下，LK溶解血栓的時間比NK少;藥物作用一定時間后，血栓溶解速率加快，面積-時間曲線變陡。可能由于持續的注射，加之管道有所阻塞使得流動液量變小，所受阻力增大，溶液在管道有所積累，導致之后溶解速率加快;另一方面藥物已和血栓充分接觸，血栓溶解作用增強。隨后血栓溶解速率變緩。

隨著藥物濃度的增加，血栓溶解速率也增加;在相同條件下，LK的平均溶解速率比NK大（見表2）。LK來源于動物組織，NK來源于微生物組織，可能因為來源不同，LK對人體血栓溶解作用更好[7]。在接近靜止狀態下，NK和LK溶栓時間分別可達260 min和150 min。血小板豐富的血栓不容易溶解，血小板被激活后可以抑制血液內纖溶酶的產生，并通過釋放的纖溶酶原激活劑的抑制劑＼|1（PAI＼|1）和α2-抗纖溶酶中和纖溶酶。此外，血小板通過它們的αⅡbβ3受體連接到纖維蛋白上引起凝塊縮回，這可能阻止了纖維蛋白溶解劑在血栓內的擴散[13]。在流動條件下，小的纖維直接通過溶栓藥物進行滲透溶解，大的凝塊從外部開始溶解，包括外緣小的纖維和栓塊。隨著管道內液體的流動，溶解產生的碎片立即被運走;同時加強了藥物的滲透作用，血栓逐漸變小以致消失。對比近靜止狀態下的血栓溶解，高流速明顯增加了血栓的溶解速率。gzslib202204012111

1.2.3 熒光成像

紅色熒光素羅丹明（Rhodamine B isothiocyanate， RBITC）標記的纖維蛋白和綠色異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，FITC） 標記的纖維蛋白原均在血栓熒光圖中存在（見圖4），說明血栓中同時存在纖維蛋白和纖維蛋白原。兩種熒光在蚓激酶作用下隨著溶解時間的延長變的越來越弱，說明蚓激酶可以同時減少纖維蛋白和纖維蛋白原。在溶解時，面積和熒光強度有同樣的降低趨勢，溶解時間越長，它們變的越小，甚至為0（見圖5）。有時該值有所增大，其原因為管道內觀測處上游血栓降解碎片隨著液體的流動在該處有所停滯。蚓激酶還可以激活纖溶酶原，間接溶栓;吸附并水解凝血因子，發揮間接抗凝作用[7]。蚓激酶可作為一種有效的溶栓藥物進行血栓疾病的治療。

2 實驗部分

2.1 芯片制備

用光刻蝕法制備芯片。在硅片表面覆蓋一層光刻膠，透過光學掩膜將光刻膠暴露于紫外燈下，將芯片模型轉移到芯片上，蝕刻未暴露的光刻膠。將成型的光刻膠作為模板，覆蓋PDMS，固化后將帶有底片的PDMS 結構取下，連接在載玻片上，85 ℃烘烤3 d。進口和出口處連接帶有醫用級聚乙烯管的不銹鋼管，連接注射泵進行液體的灌注。用質量濃度75%乙醇清洗芯片，再用蒸餾水清洗。注入230 μg/mLⅠ型酸溶性膠原蛋白 （溶劑濃度為0.5 mol/L乙酸，pH2.8），潮濕環境下放置60 min，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗去多余的未吸附的蛋白，置于潔凈環境下備用[14-15]。

2.2 血栓形成

抽取正常人體的新鮮血液，立即與質量濃度為3.2%檸檬酸鈉溶液混合（體積比為1∶9），在轉速為800 r/min、溫度20 ℃條件下，離心15 min取上清液，獲得血小板豐富的血漿，-70 ℃保存。用時將冷凍的血漿樣品在溫度37 ℃水浴中解凍3 min。用注射泵將血小板豐富的血漿注入不同管徑的芯片管道內，流速為1.5 μL/min;同時注入0.14 U/μL的凝血酶，流速為0.5μL/min，反應10 min。用顯微鏡觀察整個血栓形成過程。

2.3 血栓溶解

2.3.1 不同管徑對血栓溶解的影響

血漿和凝血酶分別按2.2中濃度和流速注入3種不同管徑（寬分別為100、200、300 μm）的芯片反應10 min，以1.5 μL/min的流速注入納豆激酶和蚓激酶（質量濃度1.5 mg/mL），用顯微鏡實時觀察其溶解過程。在特定區域至少檢測3組，溶解時間顯示其標準偏差（±SD）。選擇血栓形成量適宜和溶解速度適中的管徑進行后續實驗。

2.3.2 不同濃度藥物對血栓溶解的影響

形成穩定血栓后，納豆激酶和蚓激酶分別以0.5、1.5和2.5 mg/mL質量濃度注入芯片內，流速均為1.5 μL/min。同時設置低流速對照實驗，即以緩慢流速0.2 μL/min注入納豆激酶和蚓激酶（質量濃度1.5 mg/mL），研究動態和近似靜態條件下的血栓溶解過程。為了進一步比較不同質量濃度下的血栓溶解速率，平均溶解速率可由如下公式計算：

Rt=（Si-Sf）/T

式中：Rt為平均溶解速率;Si和Sf分別為初始和最終血栓的面積（面積為任意單位）;T為總溶解時間。

2.3.3 熒光成像

為了清楚地觀察溶解過程中血栓構成物質的變化，在已形成血栓的芯片內加入10 μL鼠抗人纖維蛋白抗體（50 μg/mL），4 ℃過夜，用pH7.4的磷酸鹽緩沖液清洗除去未結合的抗體。加入10 μL RBITC標記的羊抗鼠免疫球蛋白M（IgM）（100 μg/mL），4 ℃條件下反應12 h，用來標記血栓中的纖維蛋白。然后，用PBS清洗后，加入10 μL FITC連接的羊抗人纖維蛋白原抗體（100 μg/mL）標記血栓中的纖維蛋白原，4 ℃過夜反應后用磷酸鹽緩沖液清洗除去多余未反應抗體。用熒光顯微鏡觀察不同時間特定區域血栓的變化情況，用Image-Pro Plus 6.0分析計算累計熒光密度值和相應的面積。

3 結語

用微流控芯片模擬體內血管環境，光透性好，在顯微鏡下可清晰的觀察整個反應過程;體積較小，每次所用樣品量僅需幾十微升，可以同時在不同管徑通道進行實驗，反應迅速，大大減少了實驗時間。本研究所設計模型成功實現了體外模擬血管內血栓的形成，并可實時監測藥物溶栓過程。與體外靜態、攪拌或開放式流動條件下的血栓形成和溶解模型相比，該體系為類似封閉環境，用注射泵控制液體流速，管道內通過擴散和壓力介導的滲透效應使得溶栓酶能更好地作用于血栓，更加符合真實血管中藥物作用情況。通過熒光標記，可以進一步研究藥物的作用機制。該研究結果有利于增強血栓體外和體內實驗結果之間的連接，開發新的溶栓藥物，對血栓栓塞類疾病的基礎研究具有重要意義。

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