姜黃素通過AKT/HIF-1α/VEGF信號通路在體外抑制脈絡膜新生血管的機制

陳水齡,亢澤峰,褚文麗,郝雪蓮,陶方方,張明明,李書嬌

0引言

脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是年齡相關性黃斑病變(age-related macular degeneration，ARMD)、病理性近視(pathological myopia，PM)及中心性滲出性脈絡膜視網膜病變(central exudative choroidal retinopathy，CEC)等多種眼底疾病的病理表現。CNV的形成是多細胞與多因子共同作用的結果，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是目前已知促進CNV形成的重要的因子之一。缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)相關信號通路是參與調控這些細胞與因子活性的重要信號通路[1]。目前，中藥單體在抗新生血管方面的研究較多，尤其是在抗腫瘤新生血管方面，也為眼科新生血管類疾病的研究提供了思路。姜黃素(Curcumin)是從姜科植物姜黃、郁金、莪術提取的一種多酚類化合物，也是姜黃發揮藥理作用的主要成分，體內外實驗研究證實其藥理作用廣泛[2-3]，主要有抗炎、抗氧化、抗新生血管及抗腫瘤等[4-5]，但在CNV方面的研究較少。本研究探討姜黃素在體外抑制CNV的作用機制，為CNV的治療提供思路。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞來源人視網膜色素上皮(ARPE-19)細胞購自中國典型培養物保藏中心(CCTCC)；人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)購自美國ScienCell公司。

1.1.2主要試劑氯化鈷(CoCl2)和姜黃素(美國Sigma)，DMEM/F12培養液(美國Hyclon)，ECM培養基(美國Cell Signaling Technology)，胎牛血清(美國Gibco)，Matrigel基質膠(美國BD)，CCK-8試劑盒(日本同仁)。RNA試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)。一抗：anti-AKT和anti-p-AKT(美國CST)，anti-HIF-1α和anti-VEGF-A(美國Abcam)。

1.2方法

1.2.1CCK-8法篩選造模試劑CoCl2和實驗藥物姜黃素及陽性對照藥雷珠單抗的濃度將對數生長期ARPE-19細胞接種于96孔板培養24h；分別加入濃度為0、50、100、200、400及800μmol/L的CoCl2溶液分別培養6、12、24和48h后，每孔加入CCK-8溶液20μL，培養4h后檢測各孔在450nm的吸光度值(OD值)。以正常組細胞活性為1，各實驗組細胞活性=(實驗組平均OD值-空白孔平均OD值)/(正常組平均OD值-空白孔平均OD值)，每組3個復孔。同樣的方法加入濃度為0、6.25、12.5、25、50、100及200μmol/L姜黃素分別培養6、12、24和48h；濃度為0、5、10、20、40和80μg/mL雷珠單抗培養24h。

1.2.2CCK-8法檢測各實驗組ARPE-19細胞的活性將對數生長期ARPE-19細胞接種于96孔板中培養24h，根據分組給予不同干預，正常組：ARPE-19；模型組：ARPE-19+CoCl2；雷珠單抗組：ARPE-19+CoCl2+雷珠單抗；姜黃素低劑量組：ARPE-19+CoCl2+姜黃素低劑量；姜黃素中劑量組：ARPE-19+CoCl2+姜黃素中劑量；姜黃素高劑量組：ARPE-19+CoCl2+姜黃素高劑量組。培養24h后加入CCK-8溶液20μL，培養4h后檢測各孔在450nm的吸光度值(OD值)。以正常組細胞活性為1，各實驗組細胞活性=(實驗組平均OD值-空白孔平均OD值)/(正常組平均OD值-空白孔平均OD值)。

1.2.3RT-qPCR檢測各組細胞AKT和HIF-1α及VEGFmRNA的表達制備各組ARPE-19細胞樣本，按照Trizol說明書提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。qPCR設置反應條件：95℃×10min→95℃×15s→60℃×1min，35～40個循環，進行目的基因擴增，以GAPDH為內參，得到目的基因表達的相對定量值，進行統計學分析。其中引物由上海生工生物工程有限公司設計與合成，具體序列如下：GAPDH-F：GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA，GAPDH-R：GACTCATCGTACTCCTGCTTGCT，AKT-F：ACTGTCATCGAACGCACCTT，AKT-R：CTCCTCCTCCTCCTGCTTCT，HIF-1α-F：ACCTATGACCTGCTTGGTG，HIF-1α-R：GGCTGTGTCGACTGAGGAA，VEGF-F：GAGTACATCTTCAAGCCATCCT，VEGF-R：TGCTCTATCTTTCTTTGGTCTGC。

1.2.4Westernblot檢測各組細胞AKT、p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表達采用Western blot法檢測CoCl2(100μmol/L)對ARPE-19細胞AKT、p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白表達的影響。制備細胞樣本，提取總蛋白，BCA法計算蛋白濃度，制備蛋白SDS-PAGE膠，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜(濕轉)，抗體孵育(其中一抗稀釋比例為AKT 1∶1000，p-AKT 1∶2000，HIF-1α 1∶500，VEGF 1∶1000)，曝光顯影，測定條帶灰度值，以β-actin條帶的光密度值校正，得到目的蛋白的相對表達量。

1.2.5CCK-8法檢測缺氧條件下ARPE-19細胞姜黃素條件培養液對HUVEC細胞活性的影響根據1.2.2制備缺氧條件下ARPE-19細胞不同組條件培養液，CCK-8法檢測各組條件培養液對HUVEC細胞活性的影響(具體方法同1.2.1)。

1.2.6細胞劃痕實驗檢測各組條件培養液對HUVEC細胞水平遷移的影響待HUVEC細胞生長至80%融合時，調整細胞濃度至每毫升1×105個，接種于24孔板中待細胞生長融合成單層細胞后，用10μL微量加樣槍頭垂直于板底行“一”字形劃痕，PBS沖洗，鏡下拍攝0h和不同條件培養液干預24h后的照片(40×)，重復3次。測量并計算各組遷移率，遷移率=(S0-St)/S0×100%(S0：原始裸區面積，St：各時間點裸區面積)。

1.2.7Transwell小室法檢測各組條件培養液對HUVEC細胞垂直遷移和侵襲的影響Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲的不同在于侵襲實驗需要加入Matrigel基質膠。調整HUVEC細胞至每毫升1×105個，在Transwell的下室，根據分組給予不同條件培養液；在Transwell的上室加入HUVEC細胞懸液。加樣后培養24h，吸盡小室內液體，擦去小室內未遷移的細胞，多聚甲醛固定，結晶紫染色，晾干。倒置顯微鏡下取上下左右中間5個視野拍照(100×)，相對垂直遷移率=實驗組/正常組，相對侵襲率=實驗組/正常組。

1.2.8Matrigel基質膠法檢測各組條件培養液對HUVEC細胞管腔形成的影響96孔板中用預冷的槍頭在每孔加入Matrigel基質膠培養2h，使膠凝固。同時消化HUVEC細胞，調整至每毫升2×105個，根據分組給予不同條件培養液和HUVEC細胞懸液，接種于96孔板中培養6h。倒置顯微鏡下取上下左右中間5個不同視野進行拍照(100×)，相對管腔形成率=實驗組/正常組。

統計學分析：采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Dunnett-t檢驗，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2結果

2.1不同濃度CoCl2對ARPE-19細胞活性的影響隨著濃度的增加，細胞活性呈現先增長后抑制，當CoCl2濃度≥200μmol/L時，ARPE-19細胞的數量顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05)，鏡下可見細胞皺縮稀疏。因此，我們選擇CoCl2濃度為100μmol/L，干預24h進行后續實驗研究，見表1。

表1 不同濃度CoCl2對ARPE-19細胞活性的影響

2.2不同濃度姜黃素對ARPE-19細胞活性的影響姜黃素濃度在0～100μmol/L時，對細胞活性沒有影響，鏡下觀察細胞形態未見變化。當濃度為200μmol/L時，細胞活性明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)，鏡下觀察細胞皺縮，數量減少。因此，我們選擇姜黃素濃度為6.25、25、100μmol/L為低、中、高劑量進行后續相關實驗研究，見表2。

表2 不同濃度姜黃素對ARPE-19細胞活性的影響

2.3不同濃度雷珠單抗對CoCl2誘導的ARPE-19細胞活性的影響當雷珠單抗濃度為20μg/mL時，ARPE-19細胞的活性較CoCl2組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，與正常組比較差異無統計學意義(P>0.05)；當濃度>20μg/mL時，ARPE-19細胞的活性較CoCl2組和正常組均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。因此，我們選擇雷珠單抗濃度為20μg/mL進行后續相關實驗研究，見表3。

表3 不同濃度雷珠單抗對CoCl2誘導的ARPE-19細胞活性的影響

2.4各組間AKT和HIF-1α及VEGFmRNA相對表達量AKT、HIF-1α和VEGF mRNA相對表達量模型組均高于正常組，差異均有統計學意義(P<0.05)；雷珠單抗組均低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)；姜黃素低、中劑量與模型組比較差異均無統計學意義(P>0.05)；姜黃素高劑量組較模型組降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與雷珠單抗組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表4。

表4 各組間AKT和HIF-1α及VEGF mRNA相對表達量

2.5各組間AKT和HIF-1α及VEGF蛋白相對表達量各組間AKT蛋白比較差異無統計學意義(P>0.05)，p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白相對表達量模型組均高于正常組，差異均有統計學意義(P<0.05)，雷珠單抗組均低于模型組，差異均有統計學意義(P<0.05)。p-AKT和HIF-1α蛋白相對表達量姜黃素低、中劑量與模型組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，姜黃素高劑量組較模型組降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，與雷珠單抗組比較差異無統計學意義(P>0.05)。VEGF蛋白相對表達量姜黃素低劑量組與模型組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，姜黃素中、高劑量組較模型組降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，與雷珠單抗組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1，表5。

表5 各組間AKT和HIF-1α及VEGF蛋白相對表達量

圖1 各組間AKT和HIF-1α及VEGF蛋白相對表達量 A：正常組；B：模型組；C：雷珠單抗組；D：姜黃素低劑量組；E：姜黃素中劑量組；F：姜黃素高劑量組。

2.6ARPE-19細胞各組條件培養液對HUVEC細胞活性的影響ARPE-19細胞各組條件培養液對HUVEC細胞活性的影響比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表6。

2.7ARPE-19細胞各組條件培養液對HUVEC細胞水平遷移的影響ARPE-19細胞各組條件培養液對HUVEC細胞水平遷移的影響比較差異有統計學意義(P<0.05)。與正常組相比模型組HUVEC細胞水平遷移顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比雷珠單抗組水平遷移較少，差異有統計學意義(P<0.05)；姜黃素條件培養液低、中、高劑量組水平遷移較模型組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)，其中，高劑量組與雷珠單抗組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2，表6。

圖2 ARPE-19細胞各組條件培養液對HUVEC細胞水平遷移的影響 A：正常組；B：模型組；C：雷珠單抗組；D：姜黃素低劑量組；E：姜黃素中劑量組；F：姜黃素高劑量組。

2.8ARPE-19細胞各組條件培養液對HUVEC細胞垂直遷移的影響ARPE-19細胞各組條件培養液對HUVEC細胞垂直遷移的影響比較差異有統計學意義(P<0.05)。與正常組相比模型組HUVEC細胞垂直遷移顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比雷珠單抗組垂直遷移較少，差異有統計學意義(P<0.05)；姜黃素條件培養液低、中劑量組細胞垂直遷移與模型組相比差異無統計學意義(P>0.05)，姜黃素條件培養液高劑量組垂直遷移較模型組明顯減少，差異有統計學意義(P<0.05)，與雷珠單抗組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3，表6。

圖3 ARPE-19細胞各組條件培養液對HUVEC細胞垂直遷移的影響 A：正常組；B：模型組；C：雷珠單抗組；D：姜黃素低劑量組；E：姜黃素中劑量組；F：姜黃素高劑量組。

2.9ARPE-19細胞各組條件培養液對HUVEC細胞侵襲的影響ARPE-19細胞各組條件培養液對HUVEC細胞侵襲的影響比較差異有統計學意義(P<0.05)。與正常組相比模型組HUVEC細胞侵襲顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組相比雷珠單抗組侵襲顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05)；姜黃素條件培養液低、中劑量組細胞侵襲與模型組相比差異無統計學意義(P>0.05)，姜黃素條件培養液高劑量組侵襲較模型組顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05)，與雷珠單抗組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4，表6。

圖4 ARPE-19細胞各組條件培養液對HUVEC細胞侵襲的影響 A：正常組；B：模型組；C：雷珠單抗組；D：姜黃素低劑量組；E：姜黃素中劑量組；F：姜黃素高劑量組。

2.10ARPE-19細胞各組條件培養液對HUVEC細胞管腔形成的影響ARPE-19細胞各組條件培養液對HUVEC細胞管腔形成的影響比較差異有統計學意義(P<0.05)。與正常組比較模型組HUVEC細胞管腔形成明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較雷珠單抗組管腔形成顯著較少，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較姜黃素條件培養液低劑量組管腔形成未見明顯變化，中、高劑量組管腔形成顯著減少，差異有統計學意義(P<0.05)，其中高劑量組管腔形成與雷珠單抗組比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖5,表6。

表6 ARPE-19細胞各組條件培養液對HUVEC細胞的影響

圖5 ARPE-19細胞各組條件培養液對HUVEC細胞管腔形成的影響 A：正常組；B：模型組；C：雷珠單抗組；D：姜黃素低劑量組；E：姜黃素中劑量組；F：姜黃素高劑量組。

3討論

多種細胞成分參與了CNV的形成，其中RPE細胞是CNV的主要細胞成分之一，CNV病變早期就存在RPE細胞的萎縮或功能減退。RPE是視網膜神經上皮層和脈絡膜之間含有色素的單層細胞，它與視網膜光感受器細胞層、Bruch 膜和脈絡膜毛細血管共同組成光感受器細胞-RPE-Bruch膜-脈絡膜毛細血管復合體，在視網膜生理病理中發揮重要作用[6]，與眼底新生血管性疾病的發生發展密切相關[7-8]。在缺氧狀態下，RPE 細胞異常分泌VEGF等促血管生長因子，Bruch膜損傷，CNV形成，視網膜光感受器細胞因缺乏脈絡膜的營養供應而凋亡。內皮細胞作為組織與血液的第一道屏障，也是最先感受缺氧的細胞之一。在CNV疾病的發生發展過程中，RPE細胞缺氧、內皮細胞受損及功能障礙是其中的關鍵因素，對內皮細胞的保護可阻止其進一步惡化，達到治療疾病的目的。

缺氧誘導VEGF的表達是CNV發病機制中的重要環節。HIF-1α是細胞內氧平衡的關鍵調節因子，在缺氧誘導的血管生成、腫瘤發生、炎性反應以及細胞自噬等方面都起關鍵作用，它的激活可作為組織和細胞缺氧的直接反映與重要標志。本研究顯示，CoCl2在100μmol/L濃度時可以促進細胞中HIF-1α mRNA和蛋白的表達，這說明我們的ARPE-19細胞體外缺氧模型的建立是成功的，與以往文獻報道類似[9-10]，其機制與AKT信號通路有關。近年來大量的體內外實驗研究證實姜黃素藥理作用廣泛[2,11]，主要有抗炎、抗氧化、抗新生血管[3,5]及抗腫瘤等[12-13]，且無明顯毒副作用。姜黃素在眼科相關的研究較多，包括抑制角膜新生血管形成[13]；抑制翼狀胬肉成纖維細胞增生；抑制青光眼小梁切除術后濾過道瘢痕化；防治增殖性玻璃體視網膜病變[14-15]；抑制人[16]和動物[17-18]視網膜色素上皮細胞增殖[19]；延緩實驗動物早期[20]糖尿病視網膜病變[21]；減少[22-23]視網膜缺血再灌注損傷[24]；神經節細胞損傷的保護[25-26]及治療眼部腫瘤等[27]多方面。

正常情況下，眼部組織中VEGF表達水平很低；但在缺血、缺氧、炎癥等應激情況下[28-29]，VEGF的表達水平會顯著增高，繼而誘發新生血管形成。目前眼科臨床使用的各種抗VEGF類藥物通過抑制VEGF與受體結合從而抑制CNV生長及血管滲漏，改善或維持患者的視力。本研究顯示100μmol/L的姜黃素可減少ARPE-19細胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及蛋白的表達，可見姜黃素對CoCl2誘導ARPE-19細胞缺氧具有保護作用，但需要達到一定劑量。體外血管形成實驗可分為細胞增殖實驗、水平遷移實驗[30-31]、垂直遷移實驗[32-35]，細胞侵襲實驗[36]，管腔形成實驗，以及器官水平的人胎盤血管段培養模型和大鼠動脈環模型。目前通常所說的血管形成實驗是指細胞的管腔形成實驗，它可從側面反映毛細血管的早期形成過程，是體外檢測內皮細胞功能的指標。血管形成過程中內皮細胞會形成細胞條索，然后形成管腔。在特定條件下如基質膠、膠原等培養時可見到管腔形成[37-38]。本研究顯示姜黃素條件培養液低、中、高劑量組可降低細胞水平遷移；中、高劑量組可減少細胞管腔形成；高劑量組還可降低細胞垂直遷移及降低細胞侵襲。

綜上所述，本研究結果表明姜黃素可在細胞水平抑制新生血管的形成，其機制可能與AKT/HIF-1α/VEGF信號通路有關。但鑒于姜黃素藥理作用復雜，且體外培養的細胞成分單一，其形態、功能和體內均有一定的差別，因此，進一步完善體內實驗，證實其在抑制新生血管中的作用將為臨床應用奠定堅實基礎。