基于重水拉曼技術的白色念珠菌對變異鏈球菌代謝活性和耐藥性影響的研究

李修珍姜明張穎劉育含李帆曾飛，5馬玉瑩，5楊加震，5楊芳

1.青島大學口腔醫學院，青島266003；

2.青島大學附屬青島市市立醫院口腔醫學中心，青島266071；

3.中國人民解放軍東部戰區總醫院，南京210002；

4.天津醫科大學口腔醫學院，天津300070；

5.大連醫科大學口腔醫學院，大連116044

氟化鈉（sodium fluoride，NaF）是一種用于防齲的常見局部氟化物[1]。NaF防齲的主要作用機制：氟離子能與釉質中的羥磷灰石發生反應取代磷灰石結晶的羥離子，而形成難溶于水的氟磷灰石，增強耐酸力，促進再礦化[2]；抑制主要致齲菌的生長代謝以及胞外多糖的生成，阻礙細菌在牙面上的黏附與定植[3]；有效的抑酶劑，能抑制細菌胞內烯醇酶和三磷酸腺苷酶（adenosine triphosphatase，ATPase）的活性[4]，減少有機酸的形成。

在齲病的四聯因素學說中，病原微生物的作用占主導地位；了解微生物之間相互協作、相互競爭的關系有助于探索防治微生物感染的新策略[5]。變異鏈球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）是重要的致齲菌株，可通過細胞代謝作用將飲食中的碳水化合物轉化為酸并造成牙齒硬組織脫礦，最終導致齲齒的發生[6]。白色念珠菌（Candida albicans，C.albicans）是齲齒菌斑樣本中最常分離到的條件致病真菌種類[7]，尤其是在低齡兒童齲樣本中常與變異鏈球菌一同被檢出[8-10]。這種細菌和真菌的共生關系是否促進生物膜毒力增強有待進一步闡明[11]。因此，目前針對變異鏈球菌和白色念珠菌的相關性研究受到國內外學者的廣泛重視。

隨著細菌耐藥性問題的日益突出，臨床亟需新型抗菌劑以及創新型的藥物評價體系[12]。傳統藥物評價體系采用稀釋法和擴散法來進行監測，通過最小抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）對目標藥物進行定量評價[13]，但是不生長不代表微生物無代謝活性，此類不生長但有代謝活性（non-growing but metabolically active，NGMA）的微生物細胞往往是感染復發的關鍵[14]，增加細菌感染性疾病的治療難度。另外該評價體系只能將微生物視為表型一致的群體卻忽略細胞異質性的存在，而藥物作用下細胞的異質性正是產生耐藥性的重要途徑。重水拉曼技術則不需要外源性標記且能揭示細菌細胞的代謝活性信息，反映細胞對藥物的應激模式并評價藥物療效。其原理是當細菌攝入比胞內元素質量更大的同位素時，相應物質所對應的拉曼峰會向波數減少的方向漂移，使拉曼圖譜特定區域（2 040～2 300 cm-1）出現重水峰。同位素的特異性漂移則作為微生物是否攝入同位素標記底物和攝入量的指示標志，這與微生物在單細胞層面上的細胞功能存在密切聯系。

重水拉曼技術基于ΔC-D ratio測定的最小代謝抑制濃度（minimum inhibitory concentration based on metabolic activity，MIC-MA）可定量評價抗菌劑對目標菌種的代謝活性抑制作用[15-16]。該技術已成功應用于評價抗菌劑對細菌、真菌代謝活性的影響[16]，但是多種微生物的代謝互作以及耐藥性研究相對較少見。因此，本研究采用重水拉曼技術在單細胞尺度下，系統研究白色念珠菌對變異鏈球菌代謝活性及耐藥性的影響，為預防和治療由這兩種微生物為主引起的口腔疾病提供新的啟示和思路。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和菌株培養

1.1.1 實驗材料 實驗用標準菌株變異鏈球菌UA159、白色念珠菌ATCC10231購自中國醫學菌種保藏中心；腦心浸液培養基（brian heart infusion，BHI）固體培養基：稱取BHI粉3.85 g，1.5 g瓊脂粉，溶于100 mL雙蒸水，121℃下高溫高壓滅菌15 min，待瓊脂稍冷后超凈臺內倒平板，凝固后封口膜封口，4℃冰箱保存；BHI液體培養基：稱取BHI粉3.85 g，溶于100 mL雙蒸水，121℃下高溫高壓滅菌15 min，待冷卻至室溫時于4℃冰箱保存；NaF溶液：稱取NaF粉120 mg，溶于10 mL雙蒸水，0.22μm針頭式濾膜過濾除菌，配制成1.2 g·L-1NaF溶液，-20℃冰箱保存。

1.1.2 實驗菌株的培養 將變異鏈球菌UA159和白色念珠菌ATCC10231劃線接種到BHI固體培養基，變異鏈球菌37℃厭氧培養36 h；白色念珠菌37℃培養24 h。分別挑取變異鏈球菌和白色念珠菌菌落轉種于BHI液體培養基中，變異鏈球菌37℃厭氧活化12 h，白色念珠菌37℃活化12 h備用。

1.2 變異鏈球菌純培養體系中MIC和MIC-MA的測定

采用肉湯稀釋法測定NaF對變異鏈球菌的MIC。用分光光度計分別測定培養前后600 nm波長處的光密度（optical density，OD）值。調整菌液密度至OD600=0.5，將所獲菌液加入不同濃度NaF實驗組（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0 g·L-1）及空白對照組中，37℃厭氧培養24 h。ΔOD600（0和24 h OD600的變化）≤0.05，對應的最低藥物濃度，即NaF對變異鏈球菌的MIC[17]。

采用重水拉曼技術測定NaF對變異鏈球菌的MIC-MA。將變異鏈球菌菌液按培養體系總體積的10%接 種 至 含0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g·L-1NaF的BHI培養基（含30%重水）中，37℃厭氧培養，按0、1、2、4、8、12 h時間梯度取樣，每次取待測樣品1 000μL，用ddH2O洗滌3次，離心轉速為12 000 r·min-1，離心2 min，最后用ddH2O重懸細菌沉淀。取1.5μL重懸菌液，滴入CaF2玻片，自然風干。利用LabRam HR型的改良后共聚焦拉曼熒光顯微鏡，在100倍物鏡下隨機收集30個拉曼圖譜。參數設定如下：激光源為532 nm的Nd:YAG激光源，樣品上激光強度50 mW，照射時間1 s，分光光柵300 grooves·mm-1，拉曼圖譜范圍400～3 500 cm-1。圖譜經過減背景，基線歸一化，最大值標準化處理。計算ΔC-D ratio（培養0與8 h的C-D ratio差值），當ΔC-D ratio≤0且標準差＜0.005，即為NaF對變異鏈球菌的MIC-MA[16]。實驗重復3次。

1.3 不同濃度的白色念珠菌上清液對變異鏈球菌重水代謝能力的影響

白色念珠菌上清液的制備：取活化后的白色念珠菌菌液配置初始OD600=4的白色念珠菌菌液，作為母液，按照濃度梯度進行稀釋。將不同濃度的菌液進行離心，13 000 r·min-1離心3 min，吸取上清液并用0.22μm孔徑的過濾器進行過濾去除全部細胞后，置于4℃備用。

變異鏈球菌菌液（OD600=0.5）離心后將沉淀置于含30%濃度重水的BHI培養基中培養，同時按培養體系總體積10%的比例加入不同濃度的白色念珠菌上清液（OD600為0.05、0.1、0.5、2.5、4.0）刺激，陰性對照為純培養變異鏈球菌。將菌液放置于37℃培養箱中厭氧培養，按0、1、2、4、8、12 h時間梯度取樣，每次取待測樣品1 000μL，用ddH2O洗滌3次，離心轉速為12 000 r·min-1，離心2 min，最后用ddH2O重懸細菌沉淀。取1.5μL重懸菌液，滴入CaF2玻片，自然風干。拉曼采集條件設置詳見1.2。實驗重復3次。

1.4 混合培養體系中白色念珠菌上清液對變異鏈球菌的耐藥性影響

白色念珠菌上清液的制備方法見1.3。將變異鏈球菌接種至含不同濃度NaF（0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 g·L-1）的BHI培養基（含30%重水）中，同時按培養體系總體積的10%加入OD600=0.5的白色念珠菌上清液刺激。將菌液放置于37℃培養箱中厭氧培養，按0、1、2、4、8、12 h時間梯度取樣，每次取待測樣品1 000μL，用ddH2O洗滌3次，離心轉速為12 000 r·min-1，離心2 min，最后用ddH2O重懸細菌沉淀。取1.5μL重懸菌液，滴入CaF2玻片，自然風干。100倍物鏡下在不同視野內隨機采集30個拉曼圖譜，實驗重復3次。

1.5 統計學分析

實驗中定量數據均采用均數±標準差表示。采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析，統計方法采用T檢驗，檢驗水準為雙側α=0.05。實驗結果采用R Version 3.6.1軟件包進行統計學分析，拉曼圖譜之間的比較采用Wilcoxon秩和檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 NaF對純培養變異鏈球菌MIC和MIC-MA的測定

不同濃度NaF對于純培養變異鏈球菌的MIC測定結果。ΔOD600（0 h和24 h OD600的變化）≤0.05，對應的最低藥物濃度，即NaF對變異鏈球菌的MIC。當NaF濃度為0、0.2 g·L-1時，測得的ΔOD600分別為0.293、0.278，即ΔOD600＞0.05；而當NaF濃度為0.4、0.6、0.8、1.2、1.6、2.0 g·L-1時，測得的ΔOD600分別為0.014、0.002、0.002、0.003、0.001、0.003，即ΔOD600＜0.05。因此，NaF對變異鏈球菌的MIC為0.4 g·L-1。

不同濃度NaF對于純培養變異鏈球菌的MICMA測定結果見圖1。當ΔC-D ratio（培養0與8 h的C-D ratio差值）≤0且標準差＜0.005，即為NaF對變異鏈球菌的MIC-MA。當NaF濃度在MIC（0.4 g·L-1），2×MIC（0.8 g·L-1）時，ΔC-D ratio＞0；在3×MIC（1.2 g·L-1），4×MIC（1.6 g·L-1），5×MIC（2.0 g·L-1）時，ΔC-D ratio＜0。因此，NaF對變異鏈球菌的MIC-MA為1.2 g·L-1，即3×MIC。即NaF在MIC-MA濃度作用下變異鏈球菌的代謝活性才得到完全抑制。

變異鏈球菌UA159在不同濃度藥物[0、MIC（0.4 g·L-1）、MIC-MA（1.2 g·L-1）]刺激下，作用8 h后的C-D ratio強度見圖2所示。隨著NaF濃度升高，C-D ratio逐漸降低。

圖2 變異鏈球菌UA159在不同濃度NaF作用8 h的單細胞拉曼圖譜Fig 2 The temporal change of SCRS for S.mutans UA159 under different concentrationsof NaFat 8 h

隨著NaF濃度的升高，ΔC-D ratio呈下降趨勢，表現為負相關。當藥物濃度達到MIC-MA時，絕大多數變異鏈球菌進入小于0的“代謝靜止區”，而在MIC濃度下，大部分細菌仍存在一定的代謝活性。變異鏈球菌在不同濃度NaF作用下C-D ratio的時間梯度曲線顯示見圖3，MIC濃度下的變異鏈球菌UA159的C-D ratio有一定幅度的回升（27.2%），此時的NaF對變異鏈球菌的抑制代謝活性程度僅達72.8%，而藥物濃度在MIC-MA時，變異鏈球菌的代謝活性在12 h內始終保持在基線水平（抑制代謝活性程度=X0-X1/X0-X2，X0為12 h時對照組的C-D ratio，X1為12 h時NaF在MIC濃度下的C-D ratio，X2為12 h時NaF在MIC-MA濃度下的C-D ratio）。

圖3 12 h內變異鏈球菌在不同濃度NaF作用下C-D ratio的時間梯度曲線Fig 3 Temporal dynamics of C-D ratio of S.mutans UA159 under different concentrationsof NaFin 12 h

2.2 不同濃度的白色念珠菌上清液對變異鏈球菌重水代謝能力的影響

無藥物刺激下，變異鏈球菌在不同濃度的白色念珠菌上清液作用下C-D ratio的時間梯度曲線見圖4。當白色念珠菌上清液OD600＜0.5時，混合體系中變異鏈球菌的重水代謝能力與純培養相比差異無統計學意義（P＞0.05）。當OD600≥0.5時，變異鏈球菌的重水代謝能力明顯高于純培養體系，且在不同時間點差異均有統計學意義（P＜0.05），提示低濃度（OD600＜0.5）的白色念珠菌上清液并未引起變異鏈球菌的代謝改變。而當上清液OD=2.5、OD=4.0時，變異鏈球菌的重水代謝活性在生長穩定期（8、12 h）時與OD600=0.5時相比差異不存在統計學意義（P＞0.05）。因此OD600=0.5默認為引起變異鏈球菌UA159代謝活性升高的濃度閾值，且已經飽和。因此，本研究選取OD600=0.5來進行下一步白色念珠菌上清液對變異鏈球菌的耐藥性研究。

圖4 變異鏈球菌UA159在不同濃度的白色念珠菌上清液作用下C-D ratio的時間梯度曲線Fig 4 Temporal dynamics of C-D ratio of S.mutans UA159 under different concentrationsof C.albicans supernatant

2.3 混合培養體系中NaF對變異鏈球菌的抑菌效能評價

不同濃度NaF刺激下，變異鏈球菌在OD600=

0.5的白色念珠菌上清液作用下C-D ratio的時間梯度曲線見圖5。結果顯示在NaF濃度≤1.2 g·L-1的刺激時，白色念珠菌上清液與變異鏈球菌的混合體系重水代謝能力均較純培養體系有一定的提高，不同時間點差異均有統計學意義（P＜0.05）。而當NaF濃度＞1.2 g·L-1，這種促進作用被抑制，不同時間點差異無統計學意義（P＞0.05）。因此，白色念珠菌上清液的加入使變異鏈球菌的代謝活性升高，從而降低了其對NaF的藥物敏感性；但當NaF濃度足夠高時（4×MIC、5×MIC），混合體系中的變異鏈球菌的代謝活性同樣可得到完全的抑制，并在監測周期內未見恢復代謝活性。

圖5 不同NaF濃度時，變異鏈球菌在加或不加白色念珠菌上清液體系中的C-D ratio時間梯度曲線Fig 5 Temporal dynamicsof C-D ratio of S.mutans UA159 under different concentrationsof NaFwith or without adding the C.albicans supernatant

加入白色念珠菌上清液的混合培養體系中，NaF對變異鏈球菌的MIC-MA測定結果見圖6。隨著NaF濃度的升高，ΔC-D ratio呈下降趨勢，表現為負相關。當藥物濃度達到純培養體系的MICMA，即1.2 g·L-1，此時的變異鏈球菌仍存在一定的代謝活性，直到1.6 g·L-1，絕大多數細菌進入小于0的“代謝靜止區”。因此，混合培養體系中，NaF對變異鏈球菌的MIC-MA較純培養體系升高，即1.6 g·L-1，提示白色念珠菌上清液的加入協同增強了變異鏈球菌的毒力，使其對NaF的藥物敏感性降低。

圖6 混合體系中，NaF對變異鏈球菌UA159的MIC-MA測量Fig 6 Themeasurement of MIC-MA of NaFfor S.mutans UA159 in themixed system

3 討論

本研究采用肉湯稀釋法和重水拉曼技術，確定了純培養條件下NaF對變異鏈球菌的MIC及MICMA，定量評價NaF對變異鏈球菌的抑菌效能。同時本文建立了細菌-真菌互作模型，系統研究白色念珠菌對變異鏈球菌代謝活性及耐藥性的影響，旨在為后期探討兩菌的相互作用及產物利用關系奠定基礎。

由于在齲齒菌斑生物膜樣本的大量存在，變異鏈球菌是目前公認與齲病關系最密切的口腔細菌。變異鏈球菌的關鍵毒力因素是通過葡糖基轉移酶（glucosyltransferases，Gtfs）將膳食中的蔗糖轉化為胞外多糖，而富含胞外多糖的基質可作為一種限制擴散的屏障，加速生物膜和牙面之間酸性微環境的創建[9]。白色念珠菌是口腔常見的條件致病真菌之一，也常在齲齒菌斑樣本中被檢出。白色念珠菌和變異鏈球菌的相關性研究已有諸多報道。Falsetta等[11]通過建立嚙齒動物模型證明，變異鏈球菌和白色念珠菌之間建立了一種共生關系，協同增強牙齒表面菌斑生物膜的毒性。白色念珠菌細胞壁可提供更豐富的Gtfs結合位點，明顯提高變異鏈球菌的不溶性胞外多糖產量，從而提供大量碳源且增強變異鏈球菌在釉質表面的黏附定植，加速齲病的進展[18]。上述研究均證明白色念珠菌與變異鏈球菌之間存在協同共生效應，但也有研究持不同觀點。Willems等[19]發現在雙菌種生物膜中白色念珠菌可主動調節變異鏈球菌產酸引起的pH值降低，延緩礦物質的丟失來預防齲病。因此，這種細菌-真菌的共生關系是否促進生物膜毒力增強目前尚無定論，有待進一步的研究進行闡明。

本課題組將重水同位素標記和單細胞拉曼技術相結合，并提出新的定量指標即MIC-MA衡量藥物對細胞代謝活性的影響，在不依賴細胞培養、不改變細胞組分的基礎上，快速、定量、無損地完成目標微生物實時代謝活性的評價[15]。該技術已經成功應用于評價抗菌劑對細菌、真菌代謝活性的影響，普適性評價亦證實該技術手段敏感度高且省時的獨特優勢[17]。Tao等[16]報道變異鏈球菌UA159在≤30%重水中，生長未受到明顯抑制，且該菌活躍代謝重水并通過拉曼圖譜檢測。因此本研究選取不影響實驗菌株生長又能產生明顯重水峰的重水濃度，即30%作為后續實驗的默認濃度。

為評估NaF對變異鏈球菌的抑菌效能，筆者通過肉湯稀釋法和重水拉曼技術確定了NaF對變異鏈球菌的MIC及MIC-MA。結果顯示在MIC濃度的藥物刺激作用下細菌生長雖然受到抑制，但代謝抑制程度僅達72.8%，仍存在部分代謝活性，這一現象的出現是由于大部分細胞只是進入了NGMA的狀態[20]，這種狀態往往會增加細菌感染性疾病治療的難度，是導致感染復發的關鍵。而在基于重水拉曼技術的MIC-MA濃度下，細菌的生長和代謝在一定時間內均被完全抑制。重水拉曼技術立足于細胞代謝活性角度可對藥物作用效能做出精確的判定和評估，在細菌耐藥性研究方面有重要意義。

本研究通過建立細菌-真菌互作模型，研究白色念珠菌對變異鏈球菌代謝活性和耐藥性的影響。實驗結果顯示，白色念珠菌上清液的加入在一定程度上提高了變異鏈球菌的代謝活性，并且降低其對NaF的藥物敏感性。但是當NaF的濃度足夠高時（4×MIC、5×MIC），混合體系中的變異鏈球菌的代謝活性同樣可得到完全的抑制，并在一定時間內未見恢復代謝活性。這也從單細胞藥物評價層面證實了白色念珠菌和變異鏈球菌之間的協同關系，細菌-真菌的相互作用可以使微生物對抗菌劑的敏感性發生變化。有研究支持白色念珠菌可分解碳水化合物產生乙酸等短鏈羧酸，支持酸性環境的形成從而有利于S.mutans的生長。另外白色念珠菌可產生水解酶、磷脂酶、酸性蛋白酶等細胞外酶，釋放到培養基中產生催化作用[21]，這與本研究結果一致。因此了解這種特殊的相互作用有助于理解口腔感染性疾病的發生、發展、疾病本質，從而開發新的治療策略，有針對性的預防和治療口腔感染性疾病[22]。本研究發現即使混合體系測定的MIC-MA同樣遠低于臨床局部涂氟所用NaF濃度，即2%。這是由于目前實驗數據是在實驗室純培養條件下獲得的，而菌斑生物膜的微生物群落存在更加錯綜復雜的信息傳遞和能量轉換[23]。后續重水拉曼技術將致力于評價多菌種生物膜對于抗菌劑的反應，為減少耐藥菌株的產生，更好地指導臨床用藥奠定基礎。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。