CDH1受幽門螺桿菌感染調控及其在胃癌組織中表達分析

陳定宇，何小鳳，程 薇，全欣瑩，張 瑜，趙 艷，王琴容，周建獎，謝 淵

胃癌是我國第二大常見腫瘤，其病死率高，要降低胃癌的總體病死率，早期發現并及時治療非常重要[1]。胃癌的發生發展涉及多個方面，包括宿主因素、環境因素和幽門螺桿菌(Helicobacter pylori,Hp)感染，流行病學資料顯示Hp及其特定毒力因子與胃癌的發生相關[2]。Hp是引起胃炎、消化性潰瘍、胃癌和與黏膜相關的淋巴樣組織淋巴瘤的主要病因之一[3]。Hp對胃黏膜損傷涉及因素眾多，其中其毒素蛋白引起的損傷是一個重要的方面。Hp相關毒素蛋白包括空泡細胞毒素A(vacuolating cytotoxin,VacA)、細胞毒素相關蛋白A(cytotoxin-associated gene A,CagA)等，其中CagA是一種親水性強的、暴露于菌體表面的外膜蛋白[4-5]。課題組前期經轉錄組分析發現CagA組能引起E-鈣黏蛋白(epithelial cadherin，CDH1)表達增高[6]。CDH1是一種依賴鈣離子的細胞黏附分子，編碼E-鈣黏蛋白，主要在細胞黏附和細胞極性中發揮作用[7]。有研究[8]發現CDH1基因突變可能與彌漫性胃癌的發病有關，是彌漫性胃癌的危險因素和標志之一，而目前Hp感染對CDH1表達的影響及其在胃癌發生中的作用尚不清楚。因此，該研究用Hp灌胃蒙古沙鼠和Hp感染人胃上皮細胞分析Hp對CDH1表達的影響，數據庫分析CDH1在胃癌和癌旁組織中的表達差異、胃癌患者的預后分析及KEGG富集分析，檢測臨床人胃癌組織CDH1表達，探究Hp調控CDH1表達在胃癌發生中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1蒙古沙鼠 SPF級4～5周齡雄性蒙古沙鼠50只，體質量60～100 g，購于浙江省實驗動物中心，許可證號：SCXK(浙2003-0001)。在室溫(20±2) ℃，濕度 55%～65%，明暗交替，光照適度，通風潔凈良好條件下飼養，嚴格遵守SPF級動物管理規定進行飼養和動物實驗。

1.1.2細胞與菌株 人胃上皮細胞AGS購于ATCC細胞庫，由貴州醫科大學分子生物學重點實驗室保存。Hp國際標準株NCTC11637菌株由貴州醫科大學分子生物學重點實驗室提供。

1.1.3人胃癌組織與正常組織 人胃癌組織和正常組織由貴州醫科大學附屬醫院病理科提供，并獲得貴州醫科大學附屬醫院倫理委員會的批準及患者知情同意。

1.1.4試劑 兔抗GAPDH(10494-1-AP)購自美國Proteintech公司；兔抗CDH1(20874-1-AP)購美國Proteintech公司；山羊抗兔二抗購自美國Proteintech公司；DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；雙抗、胰蛋白酶均購自美國Hyclone公司；Western blot配膠試劑盒、蛋白提取試劑盒購自美國Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 人胃上皮細胞AGS培養在DMEM培養液中(含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素)，置于37 ℃含5% CO2的恒溫培養箱內培養，待細胞貼壁生長到密度為90%以上時進行傳代備用。

1.2.2細菌培養Hp國際標準株NCTC11637接種于含有10%綿羊血、0.4%Hp選擇劑的哥倫比亞血瓊脂平板上，置于37 ℃、5% O2、10% CO2的微需氧環境中培養，細菌接種后3 d左右待生長旺盛時，通過接種環將菌收集至含PBS的無菌離心管中，5 000 r/min、2 min離心-重懸3次，在分光光度計上確定菌液濃度。

1.2.3胃癌動物模型的構建 用Hp國際標準株NCTC11637經口接種蒙古沙鼠，間隔48 h灌胃一次，每次1 ml(15×108個/ml)，共3次，連續觀察24個月。分別選取Hp感染后3、12、24個月3個時間點，每個時間點各選取3只，組成Hp感染3、12、24個月實驗動物組。禁食24 h、禁水12 h后處死實驗動物，取出胃組織，平均分為2份，1份4%甲醛固定，1份快速液氮冷凍。以Hp未感染的蒙古沙鼠各3只為對照組。

1.2.4Hp感染細胞 在哥倫比亞血瓊脂培養基上刮下Hp，用分光光度計測量菌的濃度。取胃上皮細胞計數后按1×106個/孔接種6孔板，過夜培養使細胞貼壁后，經MOI感染復數40 ∶1感染細胞，24 h后收集樣品。

1.2.5免疫組化 石蠟包埋的組織切片置于二甲苯中脫蠟3次，每次10 min，再經乙醇水化脫二甲苯，100%乙醇作用3次，每次10 min，之后再90%、70%、50%、30%乙醇分別作用3 min，高溫高壓抗原修復，3% H2O2冷卻10 min，1×PBS洗滌切片10 min，室溫孵育一抗2 h，PBS洗滌3次，每次10 min，室溫孵育二抗2 h，DAB顯色1～3 min，PBS終止顯色，蘇木精染色3 min，ddH2O終止反應，氨水反藍1～2 min，ddH2O終止反應，50%、70%、90%、無水乙醇、無水乙醇分別作用3 min，二甲苯作用3次，每次10 min，封片。

1.2.6Western blot檢測CDH1蛋白的表達 按裂解液試劑盒說明書提取總蛋白，經BCA蛋白定量試劑盒定量后進行SDS-PAGE電泳2 h，轉膜2 h，含脫脂奶粉的1×TBST(0.05% Tween 20)溶液室溫封閉2 h，CDH1一抗(1 ∶5 000)4 ℃孵育過夜，1×TBST(0.05% Tween 20)溶液洗膜3次，每次10 min，加入二抗(1 ∶10 000)室溫孵育2 h，1×TBST(0.05% Tween 20)溶液洗膜3次，每次10 min，化學發光法(ECL)顯色，經化學發光成像儀曝光成像，ImageJ讀取灰度值。

1.3 統計學處理采用SPSS 18.0軟件進行數據分析，采用t檢驗進行組間均數比較。驗證Hp感染AGS細胞對CDH1調控的影響，采用t檢驗。驗證Hp感染感染蒙古沙鼠后對CDH1調控的影響，采用χ2檢驗。生存曲線分析采用 Kaplan-Meier 法，并采用Log-Rank檢驗。驗證CDH1在人胃癌組織及其癌旁組織中的表達情況，采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1Hp感染蒙古沙鼠胃組織CDH1的表達Hp灌胃蒙古沙鼠，分別選取Hp感染后3、12、24個月3個時間點，每個時間點各選取3只，取胃組織4%甲醛固定，石蠟包埋并制成切片。胃組織臨床病理表型Hp感染后3個月為固有層及黏膜下層血管擴張，黏膜局部淺表糜爛；Hp感染后12個月為固有層內散在淋巴漿細胞浸潤且黏膜糜爛；Hp感染后24個月固有層內散在淋巴漿細胞浸潤，部分區域輕度非典型增生且黏膜糜爛。免疫組化檢測Hp對CDH1表達的影響，Hp感染3、12、24個月胃組織CDH1陽性率分別為13.70%、13.20%、22.90%，對照組陽性率分別為0.04%、4.50%、4.77%，差異有統計學意義(χ2=6.039，P<0.05)，表明Hp感染可引起CDH1表達增高，且可能與胃部病理表型變化有關。見圖1。

圖1 Hp感染蒙古沙鼠胃組織CDHI表達

2.2Hp感染胃上皮細胞AGS CDH1的表達以MOI為40 ∶1感染胃上皮細胞細胞AGS，24 h后提取蛋白，進行SDS-PAGE電泳，Western blot檢測目的蛋白CDH1的變化。結果顯示，與未感染對照組比較，Hp感染組CDH1蛋白表達增高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 Hp感染胃上皮細胞AGS CDH1的表達

2.3 TCGA數據庫分析CDH1在胃癌和癌旁組織中的差異表達TCGA胃癌數據庫中共收集449例具有臨床病理參數的病例及其對應的CDH1 mRNA表達量。生物信息學分析得出，胃癌組標本CDH1基因表達量為(147.59±0.11)，癌旁組織組的表達量為(76.36±0.48)，胃癌組織組表達量高于癌旁組織組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 胃癌組織與癌旁組織CDH1基因表達

2.4 Kaplan-Meier Plotter數據庫分析CDH1表達與生存的相關性通過Kaplan-Meier Plotter數據庫進行生存分析，隨著在50、100、150個月的時間變化，CDH1高表達相比低表達胃癌患者生存率降低，表現為CDH1高表達胃癌患者低生存，差異有統計學意義[P<0.05,HR(95%CI)=1.49(1.25～1.77)]。見圖4。

圖4 CDH1基因高、低表達水平的胃癌患者生存率

2.5 CDH1基因KEGG富集分析通過R語言對CDH1進行KEGG富集分析，結果CDH1表達與胃癌、甲狀腺癌、膀胱癌、子宮內膜癌、黑素瘤等腫瘤相關，功能顯著富集到細菌侵襲上皮細胞、黏附連接、細胞黏附分子，通路顯著富集到Apelin信號通路、Hippo信號通路和Rap1信號通路等。見圖5。

圖5 CDH1基因的KEGG富集分析

2.6 CDH1蛋白在人胃癌組織和癌旁組織中的表達人胃癌組織和癌旁組織標本各10例，免疫組化染色檢測CDH1的表達。結果顯示，CDH1陽性率在人胃癌組織為76.27%，高于癌旁組織45.68%，差異有統計學意義(χ2=6.909，P<0.01)。見圖6。

圖6 CDH1在人胃癌組織中的表達

3 討論

胃癌是常見的消化系統惡性腫瘤之一，大部分胃癌患者為散發病例，約10%的胃癌患者存在家族聚集現象，可能與遺傳、飲食、環境等因素有關。其中，與遺傳因素相關的胃癌即彌漫性胃癌[9]。彌漫性胃癌以早發性彌漫型胃癌為特征，病理類型多為印戒細胞癌，診治困難且預后差[10]。在胃癌的發生中，Hp誘導的慢性炎癥被認為是重要的誘因之一，這也意味著環境因素可誘導細胞發生癌變，這與遺傳因素誘導的可能不同[9]。目前Hp誘導胃黏膜炎癥機制尚未完全明了，可能機制包括Hp定植引起的炎癥、Hp毒素引起的炎癥等，但其致癌機制尚不清楚[4]。研究[11]發現，彌漫性胃癌家族病例的基因分析提示，CDH1在多位點均易發生高頻突變，是彌漫性胃癌的危險因素和標志之一。而Hp感染與CDH1表達及胃癌之間的關系鮮有研究。本研究通過免疫組化檢測發現，Hp灌胃組與對照組比較，3、12、24個月3個時間點蒙古沙鼠胃組織CDH1表達量升高；Hp感染胃上皮細胞后，通過Western blot檢測發現，與對照組比較，Hp感染組CDH1蛋白表達量上升，以上結果表明Hp可上調CDH1表達。有研究[12]發現，CDH1與多種上皮來源的惡性腫瘤的發生、發展、侵襲轉移密切相關，且在多種上皮性腫瘤組織中均發現其異常表達。多數腫瘤都存在至少一個癌變驅動基因 ，CDH1種系突變便是彌漫性胃癌形成的重要驅動基因[13]。因此，本研究通過TCGA數據庫和Kaplan-Meier Plotter數據庫分析分析發現胃癌組織組相比癌旁組織組CDH1表達水平高，CDH1的高表達對胃癌患者低生存呈正相關；通過KEGG富集分析發現，CDH1表達與胃癌、細菌侵襲上皮細胞等相關；免疫組化實驗發現，人胃癌組織相比癌旁正常組織CDH1表達水平高，表明CDH1與胃癌發生可能呈正相關，提示CDH1在Hp相關性胃癌中有著重要作用。

綜上所述，CDH1表達量在蒙古沙鼠Hp灌胃組明顯高于對照組，在Hp感染AGS細胞組高于對照組；生物信息學分析CDH1基因在胃癌組織中高表達，CDH1基因高表達與胃癌不良預后呈正相關，KEGG富集得出CDH1與胃癌和細菌侵襲上皮細胞等相關；臨床人胃癌組織CDH1表達量高于癌旁正常組織，表明Hp感染引起的CDH1高表達可能在Hp相關性胃癌發生中具有重要的作用，結果為進一步探索Hp引起胃癌發生的機制和靶向治療提供理論支持。