氫化物發生-電感耦合等離子體串聯質譜法分析大米中的無機砷

李愛陽，黃建華

（1.湖南工學院材料科學與工程學院，湖南 衡陽 421002；2.湖南中醫藥研究院中醫研究所，湖南 長沙 410013）

大米為世界上一半人口的主食，特別是亞洲和非洲發展中國家，所提供能量占日常食物攝入量的70%[1]。大米的基質組成復雜，主要由碳水化合物、蛋白質、脂肪、纖維素以及礦物營養成分組成[2]。然而，大米中還含有毒理性微量元素，其中砷是研究最多的元素[3-5]。砷的毒性取決于其化學形態或物種，而不僅取決于總量，無機砷（inorganic arsenic，iAs）以亞砷酸鹽（As（III））、砷酸鹽（As（V））和氧化物（As（III、V））的形式存在，主要來源于巖石和土壤改變和侵蝕的自然釋放，或來源于采礦、冶金活動、使用殺蟲劑和燃燒不同的材料等[6-8]。iAs是已知的致癌物，被認為是毒性最強的砷物種之一，而有機砷（oAs）主要以一甲基胂酸（monomethyl arsonic acid，MMA）和二甲基胂酸（dimethyl arsonic acid，DMA）的形式存在，通常被認為毒性較小[9-11]。水稻很容易從其生長的土壤和水中吸收砷積累到谷粒中，從而導致大米中iAs濃度相對較高[12]。我國作為大米攝入量高的國家，對大米中iAs含量制定嚴格的國家標準（GB 2762—2017《食品中污染物限量》），規定大米中iAs不大于0.2 mg/kg[13]。因此，建立簡單、快速、靈敏、可靠檢測大米中iAs含量的分析方法具有重要意義。

大米中砷含量通常很低，在測定前需從樣品中提取和分離出不同形態的砷，固相萃取、濁點萃取、分散液液微萃取、氫化物發生（hydride generation，HG）等技術通常被用于提取不同形態的砷[14-17]，而離子色譜、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）以及毛細管電泳是分離不同形態砷最常用方法[18-20]。其中，HG技術使用硼氫化鈉在酸性介質中將水溶液中的物質轉化為揮發性氫化物。由于不同形態砷與硼氫化鈉反應的原理不同，并不是所有形態砷均可形成氫化物，但可以通過控制轉化條件選擇性地形成單個形態砷或具有相同性質多個形態砷的氫化物，從而無需使用色譜分離技術即可進行提取和分離出不同形態的砷。

目前，測定大米樣品中不同形態的砷含量已有大量文獻報道，通常采用原子光譜檢測技術，主要包括原子熒光光譜法[21]、原子吸收光譜法[22]、電感耦合等離子發射光譜法[23]和電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）法[24]。與其他檢測技術相比，ICP-MS具有檢出限低、靈敏度高、選擇性好等優點[25]，但來自ICP工作氣與樣品基質所形成的質譜干擾仍然影響痕量砷元素的準確測定，尤其是基于四極桿ICP-MS缺少消除質譜干擾的通用方法。電感耦合等離子體串聯質譜（inductively coupled plasmatandem mass spectrometry，ICP-MS/MS）利用雙重四極桿精準控制碰撞反應池（collision reaction cell，CRC）內的反應過程和反應產物，通過選擇合適的反應氣，幾乎可以消除所有質譜干擾[26]。本實驗利用多模式進樣系統（multimode sample introduction system，MSIS）在HG模式下，通過控制HG條件將大米中iAs選擇性生成氣態氫化物（AsH3），導入ICP-MS/MS進行測定，在MS/MS模式采用O2為反應氣消除質譜干擾，旨在無需使用色譜分離準確測定大米中iAs的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米樣品湖南秈米（產地湖南）、湖南粳米（產地湖南）、湖南糯米（產地湖南）、江西秈米（產地江西）、重慶秈米（產地重慶）、重慶粳米（產地重慶）、東北粳米（產地黑龍江）、泰國茉莉香米（產地泰國）、日本米（產地日本）、柬埔寨茉莉香米（產地柬埔寨），購于大型超市。

砷單元素標準溶液（1 000 mg/L）、銠單元素標準溶液（1 000 mg/L）、氫氧化鈉（分析純）、硼氫化鈉（分析純）、磷酸二氫銨（分析純）、氨水（分析純）國藥集團化學試劑有限公司；質量分數65%硝酸、質量分數37%鹽酸、質量分數30%雙氧水 德國Merck公司；MMA標準物質（GBW08668）、DMA標準物質（GBW08669）、砷酸標準物質（GBW08667）、亞砷酸標準物質（GBW08666） 中國計量科學研究院；國家標準參考物質大米粉成分分析標準物質（GBW(E)100348a，GBW(E)100349a） 鋼研納克檢測技術股份有限公司；標準參考物質大米粉（NIST SRM1568b） 美國國家標準與技術研究院。

1.2 儀器與設備

8800 ICP-MS/MS儀（配備MSIS附件、玻璃同心霧化器、石英雙通道Scott霧化室）、1260 HPLC儀（配備手動進樣器、單元泵） 美國Agilent公司；PRP-X100陰離子交換分析和、保護柱 瑞士Hamilton公司；Sorvall ST16R臺式高速離心機 美國Thermo Scientific公司；MARS微波消解儀 美國CEM公司；FZ102微型植物粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；HWS28電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；Milli-Q超純水儀美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 工作條件

ICP-MS/MS條件：射頻功率1.55 kW；等離子氣流速18.0 L/min；輔助氣流速1.8 L/min；載氣流速1.09 L/min；采樣深度8.0 mm；反應氣O2流速0.30 mL/min；積分時間3 s；第一質量過濾器（Q1）m/z75；第二質量過濾器（Q2）m/z91。

HPLC條件：流動相20 mmol/L磷酸二氫銨；流動相流速1 mL/min；進樣量50 μL；柱溫室溫；pH 8.0；采集時間650 s。

MSIS條件：樣品提取溶液流速0.5 mL/min；鹽酸流速2.0 mL/min；硼氫化鈉流速0.5 mL/min；內標溶液流速0.8 L/min；Ar流速0.5 L/min。

1.3.2 樣品中砷的提取

酸提取法：準確稱取0.5 g經粉碎機粉碎后的大米樣品于離心管中，依次加入0.15 mol/L硝酸9.0 mL，30%的雙氧水1.0 mL，混合均勻靜置過夜后放入恒溫水浴鍋內50 ℃提取5 min，75 ℃提取5 min，95 ℃提取10 min。冷卻至室溫，經8 000 r/min離心10 min，取上清液經0.45 μm濾膜過濾后，用超純水定容至100 mL，用于不同形態砷的測定。

微波消解法：準確稱取0.5 g經粉碎機粉碎后的大米樣品于微波消解罐內，依次加入65%硝酸4.0 mL，30%雙氧水6.0 mL，經微波消解后用超純水定容至100 mL，用于總砷的測定。

1.3.3 樣品中iAs的分離

在MSIS的HG模式下（圖1）。將大米樣品的酸提取溶液與預還原劑5 mol/L鹽酸進入MSIS前經三通毛細管線圈混合均勻，與還原劑2 g/100 mL硼氫化鈉溶液在MSIS中發生反應，在Ar的推動下，利用測定非氫化物元素的樣品引入通道加入25 μg/L銠內標溶液，將生成的氫化物氣體和內標霧化溶液導入ICP-MS/MS，測定大米中的iAs。

圖1 ICP-MS/MS的MSIS原理圖Fig. 1 Schematic diagram of the MSIS for ICP-MS/MS

1.3.4 HG-ICP-MS/MS分析

配制質量濃度分別為0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10 μg/L的系列砷標準溶液，在選定的MSIS和ICP-MS/MS條件下進行測定，同時對樣品酸提取溶液和空白溶液（酸提取法）進行測定，根據砷信號強度與內標元素銠信號強度的比值所對應的砷標準溶液的濃度建立校準曲線，并進行線性回歸，計算樣品提取溶液中總砷和iAs的含量。

1.4 數據處理

ICP-MS/MS實驗數據采用MassHunter軟件進行評估和統計，實驗圖標采用Origin 9.0繪制。

2 結果與分析

2.1 不同形態砷發生氫化物反應條件

高價砷不易發生氫化物反應，需還原為低價砷，鹽酸既能將As（V）還原為As（III），又能對樣品進行酸化，是HG最常用載流介質。分別配制1 μg/L的As（III）、MMA、DMA標準溶液，固定硼氫化鈉質量濃度為2 g/100 mL，考察鹽酸濃度變化對不同形態砷信號強度的影響。As（III）、MMA、DMA的氫化物反應方程式如下：

從圖2a可以看出，隨著鹽酸濃度的增大，As（V）在鹽酸介質中還原為As（III），經反應（1）As（III）的信號強度，當鹽酸的濃度達到1 mol/L時，As（III）的信號強度達到最大值，隨后處于平穩狀態，表明在As（III）通過氫化物反應已完全形成AsH3，當鹽酸濃度增大至4 mol/L后，As（III）的信號強度開始小幅度下降；MMA經氫化物反應（2）可生成揮發性甲基胂（CH3AsH2），但隨著鹽酸濃度的增大，MMA的信號強度逐漸減小，表明高濃度鹽酸介質抑制MMA生成甲基胂的氫化物反應，雖然MMA的信號強度一直持續下降，但由于大米中MMA的含量極低[18]，所形成的氫化物甲基胂不影響iAs的測定；DMA經氫化物反應（3）可生成弱揮發性二甲胂（(CH3)2AsH，沸點35 ℃），相比As（III）和MMA，其信號強度較低，隨著鹽酸濃度的增大，DMA的信號強度逐漸減小，當鹽酸達到4 mol/L，DMA的信號強度保持在最低水平，表明DMA氫化物反應在高濃度鹽酸介質中被抑制。因此，本實驗選擇5 mol/L鹽酸作為HG的載流介質，確保了iAs處于高信號強度而DMA處于低信號強度。

固定鹽酸濃度為5 mol/L，考察硼氫化鈉質量濃度變化對不同形態砷信號強度的影響。從圖2b可以看出，As（III）和MMA的信號強度均隨硼氫化鈉溶液質量濃度的增大而增大，而DMA的信號強度很低且基本無變化，表明增大硼氫化鈉溶液質量濃度有利于As（III）和MMA的氫化物反應，但對DMA的氫化物反應無影響。當硼氫化鈉溶液質量濃度達到2 g/100 mL后，As（III）的信號強度不再增大，DMA的信號強度仍然保持低水平，MMA的信號強度仍然繼續增大。由于大米中MMA的含量極低，僅需關注As（III）和DMA信號強度的變化。本實驗選擇硼氫化鈉溶液質量濃度為2 g/100 mL，確保As（III）保持高信號強度而DMA的信號強度處于極低水平。

圖2 鹽酸濃度（a）和硼氫化鈉質量濃度（b）對不同形態砷信號的影響Fig. 2 Effect of HCl concentration (a) and NaBH4 concentration (b) on the signal intensity of different arsenic species

2.2 質譜干擾及消除

在鹽酸介質中，砷的唯一同位素75As會受到40Ar35Cl和40Ca35Cl的嚴重干擾[27]，當樣品中稀土元素Sm和Nd含量較高時，還會受到Sm和Nd所形成的雙電荷離子（150Sm＋＋和150Nd＋＋）干擾[28]。He碰撞模式是基于四極桿ICP-MS最通用的消除質譜干擾方式，能消除大量多原子離子所形成的干擾，不能消除雙電荷離子干擾，當樣品中Sm和Nd含量較低，所形成的雙電荷離子150Sm＋＋和150Nd＋＋對75As＋的干擾可以忽略不計時，采用He碰撞模式可以消除40Ar35Cl和40Ca35Cl的干擾，但在碰撞過程中75As＋不可避免地發生能量損失，影響75As的分析靈敏度，尤其是分析樣品中超痕量As會影響結果的準確性。在ICP-MS/MS的MS/MS模式，設置Q1的m/z為75，僅允許m/z為75的離子（75As＋、40Ar35Cl＋、40Ca35Cl＋、150Sm＋＋、150Nd＋＋）進入CRC，將來自ICP的其他大量離子阻止在CRC外，向CRC內通入O2為反應氣，75As＋與O2發生質量轉移反應（75As＋＋O2→75As16O＋＋O，反應焓（ΔHr）=－0.63 eV），而40Ar35Cl＋、40Ca35Cl＋、150Sm＋＋、150Nd＋＋均不與O2反應，設置Q2的m/z為91，將75As＋通過質量轉移為75As16O＋進行測定[29]。本實驗在MS/MS模式下，選擇O2為反應氣，利用75As＋與O2發生質量轉移反應消除干擾，考察了不同O2流速下75As16O＋背景等效濃度（background equivalent concentration，BEC）的變化情況，當O2流速達到0.30 mL/min時，75As16O＋的BEC最小，本實驗選擇O2反應氣的最佳流速為0.30 mL/min。

2.3 方法的線性與檢出限

采用ICP-MS/MS對系列砷標準溶液進行測定，以砷信號強度與內標元素銠信號強度的比值（y，相對信號強度）與對應的砷標準溶液質量濃度（x，μg/L）進行線性回歸，得到砷的校準曲線為y=1.1×10－3x＋9.3×10－5，線性相關系數R=0.999 9，表明方法的線性良好；分別以空白溶液（酸提取法）連續測定10 次的3 倍和10 倍標準差所對應質量濃度為儀器的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantification，LOQ），砷的LOD為0.004 μg/L，LOQ為0.013 μg/L，將LOD乘以200（稀釋因子）換算得到方法的檢出限為0.8 μg/kg。

2.4 HG-ICP-MS/MS與HPLC-ICP-MS/MS的對比分析

采用HG-ICP-MS/MS對標準參考物質GBW(E)100348a（大米粉）、GBW(E)100349a（大米粉）、NIST SRM1568b（米粉）中的iAs進行測定，并采用ICP-MS/MS和HPLC-ICP-MS/MS分別對標準參考物質中的總砷和不同形態的砷進行測定，每個標準參考物質平行測定6 次，結果見表1。通過HPLC-ICP-MS/MS的測定結果可以看出，大米中砷的主要存在形態為iAs和DMA，而MMA的含量極低，與文獻[18]報道結果一致。采用HG-ICP-MS/MS測定標準參考物質中iAs的含量與HPLC-ICP-MS/MS的測定結果基本一致，并與標準參考物質的認定值吻合，表明通過控制HG條件（5 mol/L鹽酸和2 g/100 mL硼氫化鈉溶液）能選擇性將iAs完全轉化為AsH3，抑制DMA形成二甲胂，雖然大米中低含量的MMA能發生氫化物反應，但由于所形成的甲基胂含量太低不影響AsH3的測定，從而實現了大米中iAs含量的準確測定。HG-ICP-MS/MS在4 min內可重復測定樣品溶液5 次，而HPLC-ICP-MS/MS在10 min內僅能重復測定樣品溶液1 次，由于HPLC-ICP-MS/MS數據處理更為復雜，因此，HG-ICP-MS/MS特別適合大批量樣品的高通量分析。

表1 標準參考物質中砷的分析結果（n=6）Table 1 Analytical results of arsenic in standard reference materials (n = 6) μg/kg

2.5 樣品分析

采用HG-ICP-MS/MS分別測定10 種大米（湖南秈米、湖南粳米、湖南糯米、江西秈米、重慶秈米、重慶粳米、東北粳米、泰國茉莉香米、日本米、柬埔寨茉莉香米）中iAs含量，同時采用國標法（GB 5009.11—2014《食品中總砷及無機砷的測定》）進行對比分析[30]，每個樣品重復測定6 次。從表2可以看出，10 種大米中iAs含量在58.7～122 μg/kg之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在1.9%～4.5%之間，其中湖南粳米iAs含量最高，重慶秈米iAs含量最低。采用HG-ICPMS/MS分析結果與國標法基本一致，表明無需使用色譜技術對大米中砷進行形態分離，僅利用HG技術即可選擇性分離大米中的iAs，從而實現大米中iAs的準確測定。參照GB 2762—2017規定大米中iAs含量限量200 μg/kg的指標，10 種大米中iAs含量均低于國家標準限量值。

表2 10 種大米樣品中iAs的分析結果（n=6）Table 2 Analytical results of inorganic arsenic contents in rice samples (n = 6)

3 結 論

基于大米中砷的主要存在形態為iAs和DMA，通過優化HG條件，選擇性地將iAs轉化為AsH3， 而DMA未發生氫化物反應或發生反應形成了揮發性較弱的二甲胂，從而實現大米中iAs與oAs的分離；利用ICP-MS/MS的O2反應模式，使砷發生質譜轉移消除干擾。通過與HPLCICP-MS/MS分析結果和標準參考物質的認定值進行比較，發現該方法具有操作簡單、分析速度快、靈敏度高、準確性好、精密度高的特點，其最大的優勢是無需使用色譜技術進行砷的形態分離也能單獨測定大米中iAs的含量。對10 種大米樣品中的分析結果表明，所有樣品中iAs含量均沒超標，該方法分析能力可滿足大米中iAs的限定標準要求。