落葵薯內生真菌Fusarium graminearum TSQ-2化學成分研究

陳德坤，鄒振興*（1.中南大學湘雅藥學院，長沙 410013；2.慢病診療小分子藥物發現與轉化湖南省重點實驗室，長沙 410013）

植物內生菌是指存活于健康宿主植物組織器官內，不會引起直接、明顯的致病癥狀的一類特殊的微生物類群。研究發現，植物內生菌中發現的次級代謝產物約有51%為新型化合物，高于土壤微生物（38%），且內生菌中次級代謝產物具有多種生物活性，如抗菌、抗腫瘤等，具有潛在的藥用價值。目前，內生菌研究熱點主要為細菌與真菌，其中植物內生真菌次級代謝產物研究已成為發現新型活性化合物的重要途徑。

落葵薯

Anredera cordifolia

是落葵科藤本植物，作為一味藥食同源的新興保健蔬菜，不僅具有較好的營養保健價值，還具有降壓、抗炎鎮痛、抗菌等功效。近年落葵薯的研究主要集中在植物化學與藥理作用，而關于其內生真菌鮮有報道。課題組前期從落葵薯珠芽部分離純化得到一株內生真菌，并經ITS 鑒定菌種為

Fusarium graminearum

TSQ-2，采用現代色譜分離技術，從其次級代謝產物中得到了5 個化合物，經波譜數據分析，分別鑒定結構為zearalenone（1）、clavatustide C（2）、W493 C（3）、4，4，24-trimethyl cholesta-8，14，24（28）-trien-2

α

，3

β

，11

α

，12

β

，tetrol 12-acetate（4）、glycerolmonopalmitate（5），并對其腫瘤細胞毒活性和抗菌活性進行評價。

1 材料

液相色譜-四極桿-飛行時間質譜聯用儀（液相色譜儀型號：Agilent 1290；質譜儀型號：Agilent 6500 series Q-TOF），核磁共振儀（型號：Burker AVANCE Ⅲ 500M， 瑞士Burker 公司）；電子分析天平（型號：SQP，北京賽多利斯科學儀器有限公司）；Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠（美國GE 公司）；半制備液相色譜儀（型號：安捷倫1100，安捷倫科技有限公司）；ODS 反相C填料（日本YMC 公司）；柱色譜硅膠（80 ～100 目、200 ～300 目）；大孔樹脂（HPD-100 型大孔吸附樹脂，滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；薄層色譜用硅膠G（煙臺江友硅膠開發有限公司）；半制備色譜柱（型號：Innoval ODS-2，5 μm，10 mm×250 mm）；旋轉蒸發儀（型號：EYELA N N-1100S-W）；所用試劑均為分析純。

落葵薯植株于2019年7月采自湖南省永州市江華湘江鄉廟子源村，經中南大學湘雅藥學院徐康平副教授鑒定為落葵科落葵薯屬植物落葵薯（

Anredera cordifolia

）的珠芽。該實驗菌株分離自落葵薯珠芽，委托擎科生物有限公司進行ITS測序，NCBI 數據庫blast 比對，鑒定為禾谷鐮刀菌（

Fusarium graminearum

TSQ-2），GenBank 登錄號為No.SUYEP0UP015。目前菌種保存于中南大學湘雅藥學院天然藥物化學實驗室。

2 方法與結果

2.1 菌株發酵

將目標菌株植入液體培養基，恒溫搖床搖蕩7 d（180 r·min，28℃）作種子液，倒入20 瓶裝有固體培養基的500 mL 錐形瓶中（每瓶加入250 g 大米，250 g 超純水，121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min），于28℃恒溫下靜置培養28 d。

2.2 發酵產物的分離純化

目標菌株培養于5 kg 固體培養基28 d 后，用乙酸乙酯將固體發酵物冷浸提取3 次，每次1 d，合并提取液減壓濃縮得到總浸膏78 g。浸膏采取大孔樹脂柱層析依次以20%乙醇、80%乙醇和100%乙醇洗脫得到3 個組分。80%乙醇洗脫部位（21.0 g）經硅膠柱層析（200 ～300 目），依次采取石油醚-乙酸乙酯（100∶0 ～1∶1）及氯仿-甲醇（100∶1 ～1∶1）梯度洗脫得到8 個組分（Fr.1 ～Fr.8）。Fr.2 經硅膠柱色譜，以石油醚-二氯甲烷（100∶1 ～0∶100）梯度洗脫得到Fr.2-1 與Fr.2-2，將Fr.2-1 經凝膠柱色譜分離得到Fr.2-1-1 和Fr.2-1-2，Fr.2-1-1 經半制備高效液相色譜（80%～95%乙腈洗脫25 min，3 mL·min）分離純化得到化合物1（4.8 mg）和化合物4（8.1 mg）；Fr.3 經反相色譜柱，以甲醇-水（20∶80 ～100∶0）梯度洗脫得到Fr.3-1 和Fr.3-2，Fr.3-2 經半制備高效液相（60%～80%乙腈洗脫30 min，3 mL·min）分離純化得到化合物2（2.6 mg）和化合物5（2.1 mg）；Fr.5 經硅膠色譜柱，以二氯甲烷-甲醇（100∶1 ～1∶1）梯度洗脫，得到4 個組分，其中Fr.5-4 經半制備高效液相（40%～75%乙腈洗脫30 min，3 mL·min）分離純化得到化合物3（6.2 mg），結構見圖1。

圖1 化合物1 ～5 的化學結構示意圖Fig 1 Chemical structures of compounds 1 ～5

2.3 結構鑒定

化合物1：淡黃色粉末（甲醇），HR-EI-MS顯示

m/z

321.1713 [M ＋H]，推測分子式為CHO；H-NMR（500 MHz，MeOD）

δ

：1.34（3H，d，

J

＝6.0 Hz，H-11'），3.71（1H，t，

J

＝9.0 Hz，H-6'），5.95（1H，m，H-2'），6.20（1H，d，

J

＝2.5 Hz，H-3），6.44（1H，d，

J

＝2.5 Hz，H-5），6.71（1H，d，

J

＝15.5 Hz，H-1'）；C-NMR（125 MHz，MeOD）

δ

：19.2（C-11'），20.4（C-8''），23.7（C-4'），32.1（C-3'），32.7（C-5'），35.7（C-9'），37.2（C-7'），69.6（C-6'），74.2（C-10'），102.6（C-3），107.8（C-1，C-5），132.3（C-1'），133.2（C-2'），142.6（C-6），162.8（C-2），163.3（C-4），172.3（C-12'）。以上數據與文獻報道一致，故化合物1 鑒定為zearalenone。化合物2：白色粉末（甲醇），HR-EI-MS 顯示

m/z

566.4241 [M ＋H]。H-NMR（600 MHz，DMSO-

d

）

δ

：0.81（3H，m，H-12），7.35（1H，d，

J

＝6 Hz，H-28），7.90（1H，d，

J

＝8.4 Hz，H-35），8.27（1H，d，

J

＝9.0 Hz，H-7），8.39（1H，d，

J

＝7.2 Hz，H-14），8.67（1H，d，

J

＝6 Hz，H-21）；C-NMR（150 MHz，DMSO-

d

）

δ

：10.4（C-12），11.8（C-5），15.9（C-13），16.1（C-6），22.3（C-20），22.7（C-34），22.8（C-19），22.9（C-33），23.2（C-26），24.7（C-25），24.7（C-4），25.1（C-18），25.1（C-32），33.7（C-10），35.9（C-3），39.3（C-31），40.5（C-17），42.0（C-24），50.8（C-30），52.5（C-16），58.8（C-2），63.3（C-9），170.7（C-1），171.6（C-15），171.8（C-22），172.6（C-29），173.1（C-8），以上數據與文獻報道一致，故化合物2 鑒定為clavatustide C。化合物3：白色粉末（甲醇），HR-EI-MS顯示

m/z

888.5485 [M ＋H]， 推測分子式為CHNO。H-NMR（400 MHz，DMSO-

d

）

δ

：0.76（3H，t，

J

＝5.0 Hz，H-6），0.79（3H，d，

J

＝5.0 Hz，H-4），0.86（3H，t，

J

＝7.5 Hz，H-45），1.02（2H，m，H-5），1.13（3H，d，

J

＝5.0 Hz，H-30），3.80（1H，t，

J

＝7.5 Hz，H-2），3.90（1H，d，

J

＝10.0 Hz，H-29），3.97（1H，m，H-17），4.05（1H，m，H-25），4.49（1H，m，H-8），4.83（1H，m，H-33）；C-NMR（100 MHz，DMSO-

d

）

δ

：10.4（C-6），14.0（C-45），15.2（C-4），15.3（C-35），17.3（C-26），17.7（C-23），20.3（C-3），22.1 ～37.6（C-3/5/9/18/19/34，36 ～44），49.1（C-25），49.7（C-22），52.9（C-17），54.0（C-8），57.6（C-2），58.9（C-28），66.6（C-29），75.1（C-33），114.9（C-13），127.4（C-10），130.2（C-11/15），155.9（C-12/14），168.4（C-31），170.4（C-27），171.0（C-16），171.2（C-1），172.2（C-21），172.4（C-7），173.1（C-24），173.7（C-20）。以上數據與文獻報道一致，故化合物3 鑒定為W493 C。化合物4：白色粉末（二氯甲烷），HR-EIMS 顯示

m/z

519.3452 [M ＋Na]，H-NMR（400 MHz，CDCl）

δ

：0.86（3H，s，H-29），1.08（3H，s，H-30），1.02（6H，s，H-26/27），1.08（3H，s，H-18），1.25（3H，s，H-19），3.26（1H，m，H-3），4.27（1H，s，H-11），4.70（2H，d，

J

＝30.0 Hz，H-28），4.98（1H，s，H-12），5.61（1H，s，H-15）；C-NMR（100 MHz，DMSO-

d

）

δ

：15.5（C-29），16.9（C-18），18.0（C-6），18.2（C-21），21.3（C-32），21.9（C-26），22.0（C-27），22.3（C-19），27.1（C-7），27.5（C-2），28.2（C-30），30.9（C-23），33.3（C-20），33.8（C-22），34.4（C-25），35.0（C-1），35.3（C-16），37.3（C-10），39.2（C-4），46.5（C-13），49.1（C-17），50.2（C-5），69.0（C-11），78.9（C-12），79.0（C-3），106.1（C-28），121.4（C-15），126.1（C-8），138.4（C-9），146.8（C-14），156.6（C-24），171.0（C-31）。以上數據與文獻報道一致，鑒定化合物4 為4，4，24-trimethyl cholesta-8，14，24（28）-trien-2

α

，3

β

，11

α

，12

β

，tetrol 12-acetate?；衔?：淡黃色油狀物（二氯甲烷），HREI-MS 顯示

m/z

331.2846 [M ＋H]，推測分子式為CHO。H-NMR（600 MHz，DMSO-

d

）

δ

：0.85（3H，t，

J

＝18 Hz，H-16），1.26（24H，H-4 ～15），2.28（2H，t，

J

＝6.0 Hz，H-2'）；C-NMR（150 MHz，DMSO-

d

）

δ

：14.4（C-16），22.6（C-15），24.9（C-14），28.9（C-13），29.2（C-12），29.4（C-11），29.5（C-4 ～10），31.8（C-3），34.0（C-2），63.1（C-2'），66.0（C-4'），69.8（C-3'），173.4（C-1）。以上數據與文獻報道一致，故化合物5 鑒定為glycerolmonopalmitate。

2.4 生物活性評價

將兩株肝癌干細胞（SMMC7721 和HepG2）在含10%胎牛血清和100 U·mL青霉素/鏈霉素的RPMI-1640 培養基中、37℃下培養。將初始濃度為1×10個細胞·mL的懸液（100 μL）接種到96 孔板中，置于37℃、5%CO條件下孵育24 h。再用濃度范圍為1.25 ～80 μmol·L的目標化合物1 ～5 和1.25 ～80 μmol·L的陽性對照藥索拉非尼處理細胞。繼續培育48 h 后，每孔加入50 μL MTT（2 mg·mL）反應4 h 后加入200 μL DMSO 溶解甲臜結晶，在450 nm 處測定吸光度值（

OD

），所有結果均平行測定3 次，取平均值。計算化合物對腫瘤細胞的生長抑制率：抑制率（%）＝[1 －（

OD

－

OD

）/（

OD

－

OD

）]×100%，結果顯示僅化合物4 對SMMC7721、HepG2 細胞的增殖具有抑制活性，

IC

值分別為（23.1±1.84）和（24.2±2.16）μmol·L，陽性對照組索拉非尼的

IC

值分別為（2.19±0.04）和（4.80±0.08）μmol·L。同時還利用96 孔板稀釋法評估了化合物1 ～5 對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）和大腸埃希菌（

E.coil

）的抑制作用，結果顯示化合物1 ～5在最大濃度500 μg·mL下均未顯示抑菌活性。

3 討論

植物內生菌是一個巨大的微生物資源庫，藥用植物內生真菌作為一類特殊的微生物群體，能夠產生結構多樣的活性次級代謝產物，其中相當一部分具有抗腫瘤活性，其結構類型包括生物堿、萜類、甾體、聚酮類、脂肪酸類等，表現出潛在的應用價值，因此從藥用植物中分離內生菌并對其次級代謝產物進行研究已成為天然藥物化學研究的熱點。本研究首次對落葵薯植物內生菌進行研究，并從中分離得到兩個環五肽（1 ～2），一個三萜（3）以及一個二羥基苯酸內酯（4）和一個長鏈脂肪酸（5）。本研究報道的化合物2 和5為首次從

Fusarium

屬菌中分離獲得。在體外抗腫瘤活性測試結果顯示，化合物4 對SMMC-7721和HepG2 細胞的增殖有中等抑制活性。本研究填補了落葵薯內生真菌化學成分研究領域的空白，豐富了落葵薯內生真菌資源多樣性，在一定程度上豐富了真菌

Fusarium graminearum

次級代謝產物化學成分和生物活性，為禾谷鐮刀菌次生代謝產物的利用提供了一定的科學依據。