產醬香芽孢桿菌在醬香大曲中的生產應用研究

周 習，云 嶺，邱聲強，文成兵，唐維川，趙金松，3

（1.四川省川酒集團醬酒有限公司，四川 瀘州 646500；2.四川輕化工大學生物工程學院，四川 宜賓 644000；3.四川省酒業集團有限責任公司，四川 成都 610000）

醬香大曲是醬香型白酒的糖化劑和發酵劑。原料為小麥，經碾碎后拌入母曲和水壓制成型，放入曲房培養，培菌過程中，溫度可達60 ℃以上，曲房培養40 余天后即可出房儲存。大曲中主要有細菌、霉菌、酵母菌3 類微生物，其中細菌占絕對優勢，長期含量在80 %以上，主要包括芽孢桿菌、乳酸菌和醋酸菌，耐高溫細菌是產生醬香風味的重要因素之一，霉菌以根霉、毛霉和曲霉為主，主要參加淀粉的糖化、液化，同時產多種酶類，促進曲坯成熟，酵母菌主要起酒化和酯化的作用，由于酵母菌耐熱性差，故醬香大曲中酵母菌含量較少。

微生物的代謝產物是大曲中風味組分的主要來源，小麥中的淀粉、蛋白質等物質經過一系列的代謝途徑生成代謝產物，從而形成了大曲中復雜的風味成分。乙偶姻是醬香大曲中重要的中間體，本身具有令人愉快的奶香氣，是四甲基吡嗪等健康因子的前體物質。為改善大曲品質，本實驗利用醬香大曲中篩選出的產乙偶姻芽孢桿菌制備菌液并應用于大曲生產中，從而改善醬香大曲風味組分含量與多樣性，改善大曲品質。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

菌株：由四川省某醬酒公司成品曲中篩選得到的產乙偶姻地衣芽孢桿菌。

耗材：小麥、母曲、稻草等原輔料都由四川省某醬酒公司提供。

儀器設備：PC-16A水分測定儀，上海浦春計量儀器有限公司；FA1204B 分析天平，上海佑科儀器儀表有限公司；7890A-5975B 氣相色譜質譜聯用儀，美國Agilent。

1.2 試驗方法

1.2.1 醬香大曲生產流程

流程如下：

將潤糧后的小麥投入生產設備中碾碎為梅花瓣狀，使細粉為40%～60%，然后在小麥粉中加入5%～8%的母曲，實驗組按照原料2.5%比例在小麥粉中加入菌液，空白組則不添加菌液，然后加水拌和，使曲坯水分維持在37%～38%，由機器壓制成型，收汗后轉入曲倉培菌發酵，中途翻3 次曲，培菌40～45 d后刮曲出倉。

1.2.2 強化曲與普通曲水分檢測

在實驗倉上中下層，每層各取5 塊樣品（四周和中間各1 塊），粉碎后混勻，通過五分法取樣，利用水分測定儀檢測大曲水分。

1.2.3 強化曲與普通曲酸度檢測

按照QB/T 4257—2011 釀酒大曲通用分析方法，稱取10 g 絕干樣品，放入500 mL 燒杯中，用蒸餾水浸泡0.5 h，每隔5 min 攪拌1 次，過濾后取樣液20 mL 加入30 mL，利用NaOH 進行滴定，通過pH計檢測，pH8.2 時停止滴定，記錄消耗的NaOH 體積并計算酸度。

1.2.4 強化曲與普通曲糖化力檢測

按照QB/T 4257—2011 方法，取10 g 絕干樣品，與20 mL 乙酸-乙酸鈉緩沖液混合加入250 mL燒杯中，加水定容至200 mL，置于35 ℃恒溫水浴1 h，隨后過濾，濾液為大曲樣液，備用。

取25 mL 可溶性淀粉溶液，加入5 mL 大曲樣液和1 mL 20%NaOH 溶液。取5 mL 為空白液，用葡萄糖滴定。用另一試管取25 mL 可溶性淀粉溶液，加入5 mL 大曲樣液，35 ℃糖化1 h 后加入1 mL 20 % NaOH 終止反應，吸取糖化液通過斐林法滴定。

1.2.5 成品曲風味化合物檢測

樣品預處理：萃取頭型號為50/30 μm DVB/CAR/PDMS，取0.5 g大曲加入樣品瓶中，加入1.5 mL飽和NaCl，60 ℃恒溫水浴吸附30 min，再插入進樣口解吸5 min，解吸溫度250 ℃。

色譜條件：DB-WAX 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；He 作為載氣，流速控制為1 mL/min；采取程序升溫方案：起始溫度40 ℃，維持3 min，以5 ℃/min 速度 升至80 ℃，再 以10 ℃/min 升 至230 ℃/min 維持7 min；汽化室溫度為250 ℃；不分流進樣。

質譜條件：選擇電子轟擊電離離子源（EI），電子倍增器電壓為350 V，電子能為70 eV，發射電流為200 μA，接口溫度為250 ℃，離子源溫度為200 ℃，質量范圍控制在33～450 u。

定量方法：以2-辛酮作為內標（加入樣品的終質量濃度為0.053 g/L），樣品中鑒定的揮發性化合物以與2-辛酮質量濃度之比計算。

2 結果與分析

2.1 強化大曲與普通大曲水分含量比較

大曲中的水分在發酵過程中能夠調節品溫，吸收微生物生長代謝釋放的熱量，避免微生物細胞內溫度驟然上升而被灼傷，同時為微生物的生長代謝、孢子的發芽提供了必要條件。除此，不同水分對不同微生物的繁殖能力和酶的生成量也有影響。通常，醬香大曲出房時的水分應低于14%。

如圖1 所示，強化曲與普通曲出房水分均小于14 %，強化曲水分大約比普通曲水分高2.1%。發酵前期，微生物大量繁殖，生長代謝和產生的熱量使得曲坯內的水分快速消耗，且水是微生物生長繁殖的營養物質，此時需要大量的水分。大曲發酵完成后，需保持內部微生物結構穩定，水分控制在14%以下，微生物很難繼續生長發育。

圖1 不同大曲水分含量比較

2.2 強化大曲與普通大曲酸度比較

酸度是檢測大曲內有機酸含量高低的指標，是評價大曲質量的重要指標之一。大曲中的有機酸主要來源于微生物代謝，淀粉、蛋白質及脂肪降解。通常要求成品曲酸度在1～3.5 mmol/10 g。

由圖2 可以看出，強化曲酸度略高于普通曲0.3 mmol/10 g。醬香大曲微生物中細菌占比超過80%，又稱細菌曲，細菌種類廣、數量多是造成醬香大曲酸度高的原因之一。加入強化菌液后，直接增加了大曲中細菌數量，因此大曲酸度有小幅上升。

圖2 不同大曲酸度比較

2.3 強化大曲與普通大曲糖化力比較

糖化力是判斷曲對淀粉的糖化能力強弱的指標，醬香大曲糖化力通常在100～300 U。

如圖3 所示，強化曲糖化力高于普通曲20 U，加入強化菌液后，大曲糖化力得到明顯提升。

圖3 不同大曲糖化力比較

2.4 強化大曲與普通大曲揮發性風味成分比較

氣相色譜是一種能夠快速完成信號采集、處理并制成圖譜的技術，現已廣泛應用于食品、醫療檢驗領域。通過頂空固相微萃取結合氣相色譜質譜儀聯用技術，對醬香大曲中揮發性風味成分進行檢測，定量結果如表1所示，總離子流圖見圖4。

圖4 普通大曲和強化大曲揮發性風味成分總離子流圖

結合圖4 與表1 分析，通過HS-SPME-GC/MS在醬香大曲中共檢測到80 種揮發性風味化合物。普通大曲檢測到50 種揮發性風味成分，其中醇類11 種、芳香類8 種、醛類2 種、酸類4 種、酮類3 種、烯類1 種、酯類11 種、其他類10 種。強化大曲檢測到59 種揮發性風味成分，其中醇類14 種、芳香類3種、醛類8 種、酸類6 種、酮類4 種、烯類2 種、酯類14 種、其他類8 種。揮發性風味化合物含量占比及化合物種類數量如圖5所示。

結合表1 與圖5 可知，強化大曲揮發性風味成分多樣性與含量皆高于普通大曲，強化曲揮發性風味成分含量約為6372.58 mg/L，普通曲含量為4874.27 mg/L。兩類大曲中醇類與其他類化合物含量都相對較高，占38%～47%，隨后是酯類、醛類、酸類、酮類、烯類等化合物含量均相對較低，為1%～2%，酯類、醇類種類較多，為11～14種。

表1 普通大曲和強化大曲中揮發性風味成分 (mg/L)

3 結論

本研究通過添加產醬香芽孢桿菌制備強化醬香大曲，達到提高大曲品質的效果。實驗結果表明，強化曲出房水分為13.6%，符合出房水分要求，酸度為2.2 mmol/10 g，相較于普通曲高出0.3 mmol/10 g，強化曲糖化力為136 U，相較于普通曲約提升17%。通過HS-SPME-GC/MS 對大曲揮發性風味成分進行定性定量檢測，結果表明，強化曲揮發性風味成分達59 種，比普通曲多出9 種揮發性風味成分，風味成分含量也有較為明顯提升，強化曲揮發性風味成分含量6372.58 mg/L，約比普通曲高1500 mg/L。添加強化菌液，強化曲在理化指標以及風味成分含量與多樣性方面都得到了明顯提升，能夠有效改善大曲品質。

圖5 揮發性風味成分含量比例及種類數量