零乳糖乳酸菌發酵菌種的篩選及應用研究

李理，余騰斐，周晴晴，柯雪琴，朱珺，林國棟，李言郡，陳蘇

（杭州娃哈哈集團有限公司 杭州娃哈哈科技有限公司 浙江省食品生物工程重點實驗室，杭州 310018）

0 引言

酸奶和風味發酵乳是目前乳制品市場的寵兒，因其具有良好的口感、風味同時兼具一定促進健康的作用，越來越受到消費者接受和喜愛。與純奶相比，酸奶由于經過發酵，其中20%～30%的乳糖被分解成葡萄糖和半乳糖[1]，但是大多數市售的酸奶和風味發酵乳中仍然有2.5～3.0 g/100g的乳糖，這樣的含量對于乳糖不耐人群仍然有較大風險。

我國約有70%的人患有不同程度的“乳糖不耐癥”，長期危害在兒童中易表現為鈣吸收不良、腹瀉、體重低下及生長發育遲緩，在老年人尤其是中老年婦女中易表現為骨質疏松癥狀[2]。低乳糖或無乳糖的乳制品是解決乳糖不耐受，增加乳品消費的最佳解決方案。近幾年來，我國市場上涌現出了低或無乳糖的牛奶、酸奶都獲得了極大的成功。這些產品每年的銷量都以兩位數的速度增長，為企業帶來了良好的效益[1-3]。目前生產低或無乳糖乳制品多數采用乳糖酶水解技術，但該技術的設備和維護成本較高。與酶水解技術相比，快速且大量消耗乳糖的發酵菌種具有技術門檻低、生產成本少等優勢。Kim等人[4]通過多級篩選獲得了自發突變的乳酸菌菌株，并通過菌株組合發酵獲得低乳糖和零乳糖的發酵乳。

本研究從我國西藏地區采集的傳統發酵乳制品中分離并篩選獲得一株能夠快速且大量消耗乳糖的德式乳桿菌保加利亞菌株。該菌株發酵所獲得的發酵乳中乳糖含量達到了《GB28050-2011食品安全國家標準-預包裝食品營養標簽通則》中低乳糖和零乳糖的含量要求并可形成良好的感官品質，是生產低/零乳糖發酵乳制品的理想菌株資源。特色發酵菌種的應用為低乳糖或零乳糖發酵乳制品的生產提供了新的技術路線，具有廣闊的市場前景。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

130份傳統發酵乳制品，采集自我國西藏地區牧民自制發酵乳制品；MRS肉湯，廣東環凱微生物科技有限公司；M 17肉湯，青島海博生物技術有限公司；脫脂乳粉、濃縮乳清蛋白，恒天然（中國）有限公司；牛骨蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉浸出粉，安琪酵母股份有限公司；乳糖標準品，Sigma生物試劑有限公司；乙腈（色譜純），默克試劑；乳糖、精氨酸、半胱氨酸、乙酸鈉、硫酸鎂、硫酸錳、檸檬酸二胺等，國產分析純試劑；番茄汁，自制。MRS、M 17固體培養基在肉湯中添加1.8%的技術瓊脂，MRS培養基用于乳酸桿菌的培養，M 17培養基用于乳酸球菌的培養。

恒溫培養箱，德國賽默飛世爾科技公司；MiniforsBacteria實驗室臺式標準發酵罐，伊孚森生物技術（中國）有限公司；OptimaTMXPN超速離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；Christ真空冷凍干燥機，北京博勵有限公司；1200液相色譜系統，安捷倫（中國）科技有限公司；Delta320p H計，瑞士梅特勒-托利多有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集

使用一次性無菌吸管和勺子取適量自制發酵乳制品，迅速放入已滅菌的容器內，密封并標號，放入低溫保溫箱中。采集后樣品于4℃冰箱保存備用。樣品采集信息表見表1。

表1 采集樣品信息統計表

1.2.2 乳酸菌的分離、純化與保藏

無菌操作：1 mL或1 g樣品完全溶解于滅菌的生理鹽水中并進行梯度稀釋。經稀釋的樣品分別涂布于MRS和M 17固體培養基中，37℃培養48～72 h。觀察并記錄菌落特征。

從平板上挑取具有典型乳酸菌特征的單菌落進行革蘭氏染色，將G+菌株繼續劃線于MRS和M 17固體培養基，直至確定為純培養物。將純化的菌株再次進行革蘭氏染色并做H2O2酶試驗。

純培養物分別接種于對應的液體培養基中，37℃培養12～24 h，連續傳代培養2次，獲得的菌懸液加甘油作為保護劑，置于-80℃冰箱冷凍保存。

1.2.3 乳酸菌的鑒定

取2 mL菌懸液至無菌EP管中后密封，冷藏寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行16S rDNA測序鑒定。

1.2.4 乳酸菌發酵性能篩選

產酸性能測試。經兩次傳代的菌懸液用培養基調整OD600至0.8，按2%（v/v）接種于100 m L滅菌復原脫脂乳中，37℃發酵12 h。冷卻至室溫，按照GB5413.34中方法檢測發酵乳中的總酸含量（以乳酸計）。

感官評價。發酵乳冷卻至室溫后，按表2中的評價指標及評分標準，由10名乳品研發人員（5男5女）對各發酵乳的風味、口感、組織狀態、色澤進行評價打分。每組10份樣品，評價完成后休息15 min再進行下一組。

表2 感官評價指標及評價標準[5]

1.2.5 發酵乳中乳糖含量的檢測

經兩次傳代的菌懸液用培養基調整OD600至0.8，按2%（v/v）接種于100 m L滅菌復原脫脂乳中，37℃發酵12 h制備發酵乳，并按下述方法檢測其中乳糖含量。樣品前處理：準確稱取樣品1.00 g加入等質量無水乙醇，震蕩30 s后，12 000 rmp低溫離心10 min，取適量上清，0.22μm濾膜過濾，-20℃備用。色譜條件：液相色譜儀，Agilent 1200，色譜柱，Hypersil NH 2（4.6 mm×300 mm，5μm），流動相，乙腈∶水=75∶25，流速，1.4 mL/min，檢測器，示差折光檢測器，洗脫時間，20 min，柱溫：30℃。標準曲線的制作：將乳糖標準品配置成50.0、30.0、20.0、10.0、5.0、2.5 mg/mL的梯度濃度溶液，按照上述方法與色譜條件進行測定。以標準品的濃度為橫坐標，出峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.6 菌株高密度培養工藝優化

1.2.6.1 碳源優化

以乳糖為單一碳源，添加量分別為20、25、30、40、50 g/L，其他營養成分同MRS肉湯。經兩次傳代的菌懸液按1%（v/v）接種于不同乳糖含量的培養基中，37℃發酵9.5 h，測定發酵液OD600和活菌數，確定乳糖的最佳添加量。

1.2.6.2 氮源優化

前期氮源篩選實驗結果顯示，牛肉浸出粉、胰蛋白胨、牛骨蛋白胨對目標菌株的生長有明顯的促進作用，因此對這3種氮源的添加量進行單因素優化。

培養基中添加30 g/L乳糖和10 g/L胰蛋白胨，牛肉浸出粉分別添加5、10、15、20、30、40 g/L，其他營養成分同MRS肉湯。

培養基中添加30 g/L乳糖和10 g/L牛肉浸出粉，胰蛋白胨分別添加5、10、15、20、30、40 g/L，其他營養成分同MRS肉湯。

培養基中添加30 g/L乳糖、10 g/L牛肉浸出粉和15 g/L胰蛋白胨，牛骨蛋白胨分別添加5、10、15、20、30、40 g/L，其他營養成分同MRS肉湯。

經兩次傳代的菌懸液按1%（v/v）接種于不同氮源含量的培養基中，37℃發酵9.5 h，測定發酵液OD600和活菌數，確定復合氮源的最佳添加量。

1.2.6.3 生長因子優化

前期生長因子篩選實驗結果顯示，番茄汁和精氨酸對目標菌株的生長有明顯的促進作用，因此對這兩種生長因子的添加量進行單因素優化。

碳源和氮源按優化結果添加，番茄汁分別添加0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0 g/L，其他營養成分同MRS肉湯。

碳源和氮源按優化結果添加，番茄汁添加1.5 g/L，精氨酸分別0.02、0.05、0.08、0.10、0.15 g/L，添加其他營養成分同MRS肉湯。

經兩次傳代的菌懸液按1%（v/v）接種于不同生長因子的培養基中，37℃發酵9.5 h，測定發酵液OD600和活菌數，確定生長因子的最佳添加量。

1.2.6.4 發酵恒定p H值優化

以優化結果配置發酵培養基，發酵過程中p H值分別控制為4.8、5.0、5.2、5.5、6.0，用氨水進行調節。經兩次傳代的菌懸液按1%（v/v）接種于培養基中，37℃發酵9.5 h，測定發酵液OD600和活菌數，確定最佳的發酵恒定p H值。

1.2.6.5 發酵恒定溫度優化

以優化結果配置發酵培養基，發酵溫度分別控制為30、37、40、43℃，p H值控制為優化結果。經兩次傳代的菌懸液按1%（v/v）接種于培養基中發酵9.5 h，測定發酵液OD600和活菌數，確定最佳的發酵恒定溫度。

1.2.7 低/零乳糖發酵乳的制備

以菌株WHH 3887的凍干菌粉為直投式發酵劑，發酵基料為復原的脫脂乳，并添加適量的濃縮乳清蛋白，調整蛋白含量值≥2.9 g/100g，乳糖含量為3.22 g/100g。基料經過剪切、均質、分裝、巴氏殺菌處理后，冷卻至40℃左右，稱取適量凍干菌粉無菌操作接入基料中，混勻后至于40℃恒溫發酵10 h和24 h。破乳終止發酵，檢測各發酵乳的p H值、酸度、活菌數、乳糖含量，并進行感官評價，以市售冷鏈酸奶為對照。

1.2.8 統計分析

測定指標均表示為3次實驗的平均值±標準偏差。顯著性分析采用軟件SPSS 17.0中的Duncan’s多重比較檢驗法進行，顯著水平設置為0.05。

2 結果與討論

2.1 乳酸菌的分離、鑒定

從130份傳統發酵乳制品中共計分離等到392株菌。經革蘭氏染色鑒定、H2O2酶試驗和16S rDNA序列測序后得到387株乳酸菌和5株酵母菌。乳酸菌菌株光學顯微鏡下觀察分別呈現球狀、鏈球狀和桿狀。部分分離菌株經革蘭氏染色后，在顯微鏡下觀察的細胞形態如圖1所示。

圖1 乳酸菌分離株革蘭氏染色顯微鏡下細胞形態

2.2 乳酸菌的發酵性能篩選

乳酸菌發酵時可以利用乳糖經糖酵解途徑產生乳酸，乳酸菌產酸能力與菌體細胞內β-半乳糖苷沒的量相關[6]。因此可以根據產生乳酸的多少間接衡量菌株對乳糖的利用情況。對387株乳酸菌在復原脫脂乳發酵12 h后的總酸含量進行測定，同時對發酵乳的感官品質進行評價打分。結果顯示，387株乳酸菌中有26株乳酸菌發酵后所得發酵乳的總酸含量≥10.0 g/L（以乳酸計）且感官評價打分高于80分，說明這些菌株對乳糖的利用較好，同時能夠形成良好的發酵乳質構和風味，結果表3所示。

表3 發酵性能較優的乳酸菌發酵乳的酸度及感官評價

（續表3）

2.3 乳酸菌消耗乳糖的能力篩選

對初篩得到的26株乳酸菌37℃發酵復原脫脂乳12 h后所得發酵乳中的乳糖含量進行檢測，結果如表4所示。

表4 26株乳酸菌發酵乳中乳糖含量

由表4可以看出，菌株WHH 3887經發酵后乳糖殘留量最低，僅為1.41±0.02 g/100g，達到了GB28050-2011中對低乳糖乳制品中乳糖含量的限制要求。伍桃英[7]采用不同型號的乳糖酶水解乳糖制備低乳糖乳品中乳糖的含量為0.696 g/100g，該結果說明菌株WHH 3887作為生產低乳糖的發酵乳制品是非常有潛力的。

2.4 菌株WHH3887的高密度發酵工藝優化

2.4.1 碳源、氮源優化

培養基中的碳源、氮源種類和添加量是影響菌株生長的重要因素，同時有研究報道指出[2]，乳糖酶作為一種誘導酶，底物的存在會誘導其表達。以乳糖作為菌株3887發酵的單一碳源，考察不同添加量對其生長的影響，結果如圖2(a)所示。當乳糖為單一碳源時，隨添加量逐漸增加，菌株WHH 3887菌懸液的OD值和活菌數呈現先增加后下降的趨勢，當添加量為30 g/L，OD值和活菌數均達到最高，且顯著高于其他添加濃度（P＜0.05），因此，后續優化實驗乳糖的添加量為30 g/L。

以單因素實驗考察菌株WHH 3887高密度發酵的最佳復合氮源，結果如圖2(b)～2(d)所示。牛肉浸出粉的添加量為10 g/L和15 g/L時，菌懸液的OD值和活菌數較高，差別不顯著（P=0.083），繼續增加反而下降。胰蛋白胨和牛骨蛋白對影響菌體生長情況與牛肉浸出粉的影響相似，添加量分別為為15 g/L和20 g/L時，菌株的生長最好，且顯著優于其他添加濃度（P＜0.05）。綜合優化結果和生產成本，菌株WHH 3887高密度發酵的復合氮源為牛肉浸出粉10 g/L、胰蛋白胨15 g/L、牛骨蛋白胨為20 g/L。經過碳源和氮源的優化后，發酵液活菌數達到了8.9×108CFU/m L，較優化前提高了4.63倍。

圖2 菌株WHH3887碳源、氮源添加量優化

2.4.2 生長因子優化

經過碳源和氮源的優化，菌株WHH 3887的生長有所改善。根據前期生長因子的篩選結果，對番茄汁和精氨酸的添加量進行優化，并發現添加番茄汁1.5 g/L和精氨酸0.1g/L的效果最優圖3(a)和3(b)。李佳[8]的研究指出，1%的番茄汁對保加利亞乳桿菌LB5的生長有明顯的促進作用；侯聚敏[9]也指出番茄汁可以促進乳酸菌的增殖。

圖3 菌株WHH3887生長因子優化

2.4.3 恒定p H值、培養溫度優化

研究結果發現，菌株WHH 3887在培養時控制p H和不控制p H值的生長情況差別顯著，這是由于乳桿菌在培養過程中大量產酸，從而會對菌體的生長產生抑制。本研究中，不控制pH值時，發酵液活菌數僅為7.35×108CFU/mL，p H值控制為5.5時，發酵液活菌數顯著提高到1.37×109CFU/mL（圖4a）。黃良昌等[10]通過研究發現了控制p H值為5.8時，培養的保加利亞乳桿菌發酵液活菌數也較未控制p H值時有顯著的提高。

保加利亞乳桿菌屬于嗜溫乳酸菌，優化溫度范圍選擇30～43℃，結果發現，30℃和43℃時菌株的生長明顯受到抑制，40℃最佳且差異極顯著（P≤0.01），活菌數最高達到1.89×109CFU/mL（圖4b）。

圖4 不同pH值和培養溫度對菌株3887生長的影響

經過碳源、氮源、生長因子、發酵條件等一系列關鍵工藝條件的優化，菌株WHH 3887的發酵液活菌數由初始的1.92×108CFU/mL提高到了1.89×109CFU，培養優化效果顯著。

2.5 低/零乳糖發酵乳制備及穩定性跟蹤

按照優化工藝對菌株WHH 3887進行高密度培養并制備凍干菌粉，作為發酵劑使用。分別發酵10 h和24 h后終止發酵，得到的發酵乳10℃后熟12 h，進行測試，結果如表5所示。

由表5中結果可以發現，使用菌株WHH 3887制備的發酵乳在pH值、酸度、活菌數和感官評分方面的指標與3份市售發酵乳基本一致，其中使用菌株WHH 3887自制的發酵乳比市售酸奶的活菌數高，但發酵24 h后的酸度明顯偏高，從而影響了口感，導致感官評分較低。乳糖含量方面，3份市售酸奶的乳糖含量均在3%左右，而采用菌株WHH 3887制備的發酵乳，發酵10 h后，乳糖含量為1.83 g/100 g，達到了國標GB28050-2011中低乳糖含量的宣稱，繼續發酵24 h，乳糖含量進一步下降至0.44 g/100 g，達到了國標GB28050-2011《食品安全國家標準-預包裝食品營養標簽通則》中零乳糖含量的宣稱。

表5 不同發酵乳樣品測試指標

3 結論

本研究經過發酵性能初篩和乳糖消耗能力復篩，獲得一株能夠良好發酵牛乳同時大量消耗乳糖的乳酸菌，經過鑒定該菌株為德式乳桿菌保加利亞亞種，并命名為WHH 3887。經過碳源、氮源、生長因子及培養條件的優化，菌株3887的活菌數顯著提高，經優化后發酵液的活菌數可達到1.89×109CFU/mL，經冷凍干燥后菌粉的活菌數達到了1.93×1011CFU/g。以凍干粉為直投式發酵劑制備的發酵乳，發酵10 h后乳糖含量為1.83 g/100 g，發酵24 h后乳糖含量為0.44 g/100 g，分別達到了國標GB28050-2011《食品安全國家標準-預包裝食品營養標簽通則》中零乳糖含量的宣稱。同時，發酵乳在PH值、酸度、活菌數和感官品質方面與市售的冷鏈酸奶基本一致，說明該菌株是生產低乳糖或零乳糖發酵乳制品的理想發酵菌種。后期研究可將菌株WHH 3887與嗜熱鏈球菌或乳酸乳球菌進行復配發酵，以改善零乳糖發酵乳酸度較高的問題，提升特色發酵劑菌株的產業化應用。