2型糖尿病患者血清semaphorin3A水平與骨密度及骨代謝指標的相關性分析

陳鏡 馮正平

重慶醫科大學附屬第一醫院內分泌科，重慶 400016

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)和骨質疏松癥是常見的慢性疾病，其患病率逐年上升。目前我國的糖尿病患病率高達11.2%，50歲以上人群骨質疏松患病率高達19.2%。2型糖尿病患者因為持續高血糖狀態、胰島素相對或絕對缺乏、糖尿病微血管病變及體內激素水平的改變等原因，其患骨質疏松及骨質疏松性骨折的風險明顯升高[1]。信號素3A(semaphorin3A，Sema3A)作為信號素家族中的一員，是胚胎發育、腫瘤發生、免疫調節及骨發育的重要調節因子[2-3]。在骨重建過程中，Sema3A通過抑制骨吸收和促進骨形成發揮骨保護作用[4-5]。動物研究[6]表明高糖可降低Sema3A及其受體神經纖毛蛋白-1(neuropilin-1，Nrp1)的表達，并且降低成骨相關基因的表達，從而抑制成骨分化。有關糖尿病患者血清Sema3A水平與骨代謝的相關性尚無報道。本研究旨在觀察2型糖尿病患者血清Sema3A水平與骨密度、骨代謝指標的相關性，為臨床防治糖尿病合并骨質疏松提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年3月至2021年1月于重醫附一院內分泌科住院的2型糖尿病患者共129例。根據DXA測定的腰椎(L1～L4)或股骨頸或全髖骨密度，按T值分成骨質疏松組(62例，T值≤-2.5)和非骨質疏松組(67例，T值>-2.5)，其中非骨質疏松組包括低骨量和正常骨量患者。該研究通過醫院倫理委員會批準，由于ELISA檢測標本來自內分泌實驗室廢棄血標本，故免除知情同意。

1.1.1納入標準：①根據1999年WHO的糖尿病診斷標準診斷2型糖尿病；②自然絕經后女性；③男性年齡≥50歲。

1.1.2排除標準：①1型糖尿病、妊娠糖尿病、特殊類型糖尿病或合并糖尿病急性并發癥(如高血糖高滲狀態、酮癥酸中毒)；②合并有惡性腫瘤、甲狀腺或甲狀旁腺疾病、腸胃營養不良、嚴重感染等影響骨代謝的其他內分泌疾病或慢性疾病；③合并有過敏性鼻炎、過敏性哮喘、自身免疫性疾病等；④嚴重的肝腎功能不全；⑤近6個月內有急性心腦血管事件發生者；⑥服用影響骨代謝藥物或接受過抗骨質疏松治療(如雙膦酸鹽、甲狀旁腺素、雌激素、糖皮質激素、免疫抑制劑等)。

1.2 研究方法

1.2.1臨床資料的收集：收集兩組患者的臨床資料，包括性別、年齡、糖尿病病程、身高、體重，并計算BMI。

1.2.2骨密度的測定：采用美國HOLOGIC公司的Discovery A(S/N 87352)骨密度儀雙能X線吸收法(DXA)測定腰椎(L1～L4)、全髖及股骨頸骨密度，單位為g/cm2，CV值為1.0%。

1.2.3Sema3A的測定：清晨空腹采集靜脈血，分裝于離心試管中在室溫放置2 h，然后1 000 r/min離心15 min，取上清液將其置于-80 ℃低溫冰箱保存待測。采用江萊生物的人Sema3A ELISA試劑盒測定，板內CV值<9%，板間CV值<11%。每例血清樣本均設2個測試孔，最終反應板在酶標儀(美國Thermo公司)450 nm處讀取吸光度值，并取其2個測試孔吸光度平均值，在Excel工作表中繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。

1.2.4骨代謝指標及各生化指標的測定：①血PINP、血OC、血β-CTX均采用電化學法測定；②血BALP、血PTH均采用化學發光法；③血25(OH)D采用雙抗夾心酶聯免疫法；④血Ca、血Mg、血P采用自動生化分析儀測定；⑤隨機UALB/Cr采用透射比濁法；⑥ HbA1c采用高壓液相離子交換層析法。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0統計軟件分析處理數據，正態性檢驗采用單個樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗。滿足正態分布計量資料用均值±標準差表示，采用t檢驗；非正態分布計量資料用中位數(四分位數范圍)[M(P25～P75)]表示，采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料用例數表示，采用卡方檢驗。兩個連續性數值變量采用Spearman相關分析。血清Sema3A水平與骨密度及骨代謝指標的相關性采用多元線性回歸分析方法。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 2型糖尿病患者的臨床資料

2型糖尿病患者骨質疏松組和非骨質疏松組間糖尿病病程、HbA1c、隨機UALB/Cr相比差異無統計學意義(均P>0.05)。兩組間性別比例、年齡、BMI相比差異有統計學意義(均P<0.01)，其中骨質疏松組年齡高于非骨質疏松組，而BMI水平低于非骨質疏松組。與非骨質疏松組相比，骨質疏松組患者女性占比明顯更高。見表1。

表1 2型糖尿病患者的臨床資料Table 1 The clinical data of T2DM

2.2 2型糖尿病患者的血清Sema3A、骨密度、骨代謝指標

2型糖尿病患者骨質疏松組腰椎骨密度、全髖骨密度、股骨頸骨密度明顯低于非骨質疏松組(均P<0.01)。血清Sema3A水平骨質疏松組顯著低于非骨質疏松組(P<0.05)。血清β-CTX在骨質疏松組較非骨質疏松組明顯升高(P<0.05)。和非骨質疏松組患者相比，骨質疏松組血PINP、OC、BALP、PTH升高，25(OH)D降低，但差異無統計學意義(均P>0.05)。見表2。

表2 2型糖尿病患者的血清Sema3A、骨密度、骨代謝指標Table 2 Serum Sema3A, BMD, and bone metabolic indicators in T2DM

2.3 2型糖尿病患者血清Sema3A水平與各參數間的相關性

2型糖尿病患者血清Sema3A水平與腰椎骨密度、全髖骨密度、股骨頸骨密度呈正相關，相關系數r分別為0.310、0.239、0.203，P值分別為<0.001、0.006、0.021。血清Sema3A水平與OC呈負相關，相關系數r為-0.177，P值為0.045。Sema3A與PINP、β-CTX、BALP、PTH呈負相關，與25(OH)D呈正相關，但無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 2型糖尿病患者血清Sema3A水平與各參數間的相關性Table 3 The association between serum Sema3A level and other variables

2.4 2型糖尿病患者血清Sema3A與骨密度、骨代謝指標的多元回歸分析

多元回歸分析結果顯示，校正可能的混雜因素年齡、糖尿病病程、BMI、HbA1c后，血清Sema3A與腰椎骨密度、全髖骨密度、股骨頸骨密度均呈正相關(P<0.05)。進一步校正性別后，血清Sema3A水平與腰椎骨密度仍呈正相關(B=0.002，P=0.035)；與全髖骨密度、股骨頸骨密度呈正相關，但無統計學意義(P>0.05)。在校正年齡、糖尿病病程、BMI、HbA1c后Sema3A與PINP呈負相關(B=-0.340，P=0.048)；與OC、β-CTX呈負相關，但無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 2型糖尿病患者血清Sema3A與骨密度、骨代謝指標的多元回歸分析Table 4 Multiple regression analysis between Sema3A and BMD and bone metabolic indicators in T2DM patients

3 討論

骨質疏松癥多見于絕經后女性及老年男性，我們的研究發現，在2型糖尿病患者中，絕經后女性比男性更容易患骨質疏松，與以往的研究結果一致。這與絕經后女性體內雌激素水平降低后對破骨細胞的抑制作用減弱，導致其骨吸收功能增強有關[7]。在2型糖尿病患者中，骨質疏松組年齡大于非骨質疏松組，表明了骨質疏松癥是一種與增齡相關的代謝性疾病[8]。首先，增齡可以導致骨重建失衡，骨吸收與骨形成的比值升高，從而導致進行性的骨量丟失；其次，增齡可以使免疫系統呈低度活化狀態，白介素-1(IL-1)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎性反應介質可以刺激核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)和巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)表達，從而刺激破骨細胞，抑制成骨細胞，造成骨量的減少。有研究[9-10]表明肥胖可能會導致骨密度增加，與骨密度呈正相關，與骨質疏松呈負相關。BMI下降或低BMI是老年女性和男性骨折發生率較高的獨立危險因素[11]。本研究也發現骨質疏松組患者BMI更低，這可能與體內較低的17β-雌二醇水平和較低的機械負荷有關。

Sema3A是脊椎動物中發現的第一個信號素。它最初被認為是一種可擴散的軸突導向分子，誘導神經系統的生長和發育。然而，研究發現Sema3A在骨重建中也發揮著重要作用。Sema3A基因敲除小鼠的原代成骨細胞存在分化缺陷，成骨細胞標志物Runx2和Bglap2表達降低[12]，而骨保護素(OPG)缺陷的小鼠顱骨細胞培養液中加入Sema3A能抑制破骨細胞的成熟。在一項基于Sema3A基因治療的骨靶向給藥系統的研究[13]顯示，經過Sema3A治療的小鼠破骨細胞數量明顯減少，成骨細胞數量明顯增加，骨密度、骨體積/組織體積(BV/TV)、骨小梁數量(Tb.N)和骨小梁厚度(TB.Th)均顯著高于對照組。靜脈注射Sema3A可加速鉆孔損傷所致皮質骨缺損小鼠模型的骨再生，去卵巢(ovariectomized，OVX)誘導的骨質疏松小鼠模型也顯示Sema3A可以減少卵巢切除后所致的骨量丟失[12]。在本研究中，我們發現在2型糖尿病患者中，骨質疏松組患者血清Sema3A水平明顯低于非骨質疏松組，Sema3A與各部位骨密度呈正相關。其可能的機制有如下幾個方面：一方面Sema3A與從狀蛋白-A1(plexin-A1)和Nrp1受體復合物結合后影響免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)信號通路和RhoA激活，從而抑制破骨細胞分化和破骨前體細胞遷移；另一方面Sema3A和Nrp1的結合還可以增加Rac1的表達，促進β-catenin在細胞核內聚集，增加成骨細胞分化、增殖[12]。而高糖可以降低Sema3A及受體Nrp1的表達，顯著抑制成骨分化。Ma等[14]研究也表明糖尿病可能通過調節Sema3A/IGF-1/β-catenin信號通路來干擾骨代謝。基于此，調節血清Sema3A水平可能成為骨質疏松治療的新靶點，特別是為糖尿病合并骨質疏松患者的治療提供新思路。

既往有研究[15]表明在人體中血清Sema3A水平隨年齡的增長或絕經而降低。而本研究顯示年齡與Sema3A無明顯相關性，分析可能與本研究選取的研究對象年齡較大，不能代表一般人群Sema3A水平有關。OC是一種由成骨細胞分化后期分泌的非膠原性、依賴維生素K的蛋白質，其不僅能夠調節成骨細胞及破骨細胞的活性，還是骨礦化速率的調節因子。本研究發現2型糖尿病患者骨質疏松組OC、PINP、β-CTX水平更高，血清Sema3A水平與OC、PINP、β-CTX呈負相關趨勢，這可能與骨質疏松患者骨轉換增加，成骨細胞、破骨細胞活性增強有關。

本研究也存在一定局限性。首先，因為研究的樣本量有限，未能對研究對象進行更詳細的分層分析，若后續研究中能夠繼續擴大樣本量，可按照T值進行更詳細的分組。其次，由于研究對象為2型糖尿病病人，糖尿病病程相對較長，雖然已調整了一些混雜因素，但可能存在部分混雜因素如血糖等仍未被調整。

本研究發現，2型糖尿病合并骨質疏松患者血清Sema3A水平明顯降低，校正骨質疏松的可能影響因素后血清Sema3A水平與腰椎骨密度仍呈正相關，與PINP、OC、β-CTX等骨代謝指標有一定相關性。未來Sema3A可能成為篩選抗骨質疏松藥物的新的靶點。