PM2.5懸滴液對去勢后雌性SD大鼠骨密度的影響

張小蕊 黃惠娟 林妹珠倪清麗 王海紅 楊薈 張賢丹 李秋月 游夢婷梁啟妍

1.福建醫科大學福總臨床醫學院婦產科，福建 福州 350025

2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九○○醫院婦產科，福建 福州 350025

3.廈門大學附屬東方醫院，福建 福州 350025

絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis, PMOP)是指女性絕經后卵巢內分泌功能失調衰退，雌激素水平明顯減少，導致以骨量減少、骨的微觀結構退化為主要特征的一種全身代謝性疾病，易發生骨折。骨折以發生在腰部、股骨上端、腕骨較為常見。目前骨質疏松癥(osteoporosis，OP)診斷的主要基于雙能X射線吸收測定法(DXA)骨密度(bone mineral density，BMD)測量結果和(或)脆性骨折[1]。PM2.5是指空氣動力學等效直徑等于和小于2.5 μm的大氣顆粒，其基本特征是體積小、重量輕，在大氣中滯留時間長，可以被大氣環流輸送到很遠的地方，因而對人體健康的影響很大[2]。根據相關研究發現，北京空氣中的PM 2.5濃度最高可達82.6 μg/m3[3]，同期北京當地居民的50～59歲骨質疏松發病率為18.9%，60～69歲為52.21%，70～79歲為77.59%，80歲以上為95.24%，均高于同期PM2.5濃度較低的城市[4]。既往研究[5-7]表明，PM2.5可通過影響骨代謝的炎性效應機制、受體競爭機制、雌孕激素受體機制等多種途徑降低骨密度，直接或間接引發或加劇OP。但PM2.5對于絕經后骨質疏松的影響機制還有待探討。本研究擬通過觀察PM2.5懸滴液滴注對去勢后雌性SD大鼠骨密度的影響，為PM2.5污染與絕經后女性骨質健康的關系提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 動物及分組

40只3周齡雌性Sprague-Dawley健康大鼠，動物的數量由前期預實驗結果統計學計算得出，購買上海于克萊斯實驗動物有限責任公司，體重為(60±10)g，實驗動物生產許可證號：SCXK(滬)2017-0001。按照隨機數字表法將其分成對照組和實驗組，每組20只，飼養在聯勤保障部隊第九○○醫院比較醫學科動物實驗中心SPF級動物房，提供專用飼料飼養，保證每日光照時間一定，室溫 18～25 ℃，自由攝食和飲水。動物實驗管理依照實驗動物管理委員會指導方案進行。

1.2 PM2.5的采集及配置

2018年4月至2019年4月，在聯勤保障部隊第九○○醫院婦產科病房樓樓頂(靠近福建省福州市鼓樓區西二環北路交通繁忙路段)用大流量采樣器和PM2.5采樣頭，收集本地區大氣PM2.5樣本。每連續采樣24 h更換一次濾膜。采樣后的濾膜用錫紙包裹，置于4 ℃保存。將PM2.5萃取后依據《中華人民共和國環境空氣質量標準》(GB3095-2012)一、二級標準日均濃度限值及我國城市PM2.5年平均濃度水平推算，將PM2.5粉末稱重，加入PBS磷酸緩沖鹽溶液配制成濃度為劑量75 μg/m3的懸濁液，保存于4 ℃冰箱中。

1.3 PM2.5暴露標準與氣道滴注方法

每天早上8：00開始，用乙醚麻醉雌鼠后，用氣管滴注法滴入大鼠肺部進行染毒試驗。依據《中華人民共和國環境空氣質量標準》(GB3095-2012)一、二級標準日均濃度限值及我國城市PM2.5年平均濃度水平，以及國際環保組織綠色和平發布的《2015年度中國366座城市PM2.5濃度排名》中PM2.5年均濃度150 μg/m3及參照吸入的PM2.5在氣道深部和肺的沉積率為70%進行計算，計算得出大鼠24 h PM2.5吸入量分別為：5.52 μg/d。每隔2 d滴注1次，持續染毒9個月。

1.4 大鼠去勢術

PM2.5氣道滴注5月末，實驗組大鼠行雙側卵巢切除術，對照組大鼠行雙側卵巢旁脂肪組織摘除術。大鼠于手術前一天禁食禁水6～8 h，使用3%濃度的戊巴比妥鈉對大鼠進行腹腔注射麻醉(1 mL/kg)，于大鼠中下背部備皮，手術切口選擇雙側背部長度約1 cm的縱行切口，術中于卵巢與子宮末端之間的最細處用小號止血鉗夾閉，1號絲線結扎后切除全部卵巢，還納后分別縫合肌肉層和皮膚，對皮后酒精棉球消毒手術切口。術后3 d進行肌注20萬單位的青霉素1 mL/d。對照組采用同法切除雙側卵巢旁脂肪組織。

1.5 骨密度測量

在氣道滴注實驗進行的第5、7個月末及9月末，對大鼠各部位進行骨密度的測量，每次檢測前一天禁食禁水8 h，用3%濃度的戊巴比妥鈉對大鼠進行腹腔注射麻醉(1 mL/kg)，運用雙能X線測量儀設備(來源于福建省中醫藥研究院)在高分辨率模式下對大鼠右脛骨、右股骨、腰椎 (L4～L6)掃描。在實驗過程中大鼠因手術或麻醉等原因出現死亡，至實驗結束，對照組大鼠剩13只，實驗組大鼠剩16只。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 PM2.5滴注5月末兩組骨密度比較

染毒5月末(未去勢前)，測量對照組和實驗組脛骨、股骨、腰椎3個部位的骨密度，將對照組和實驗組的3個部位骨密度分別進行比較，兩組脛骨、股骨、腰椎的骨密度差異均不具有統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 5月末骨密度變化Table 1 Bone mineral density change at the end of g/cm2)

2.2 離體后兩組骨密度變化

手術后持續染毒4個月后取大鼠右脛骨、右股骨及腰椎L4～L6離體測BMD(表2)，實驗組與對照組的脛骨、股骨、腰椎的骨密度差異均具有統計學意義(P<0.05)。

表2 離體后骨密度變化Table 2 Change of bone mineral density after g/cm2)

2.3 對照組各部位骨密度變化

隨著染毒時間的增加，對照組3個部位骨密度均呈下降趨勢，其下降程度：腰椎>股骨>脛骨。見圖1。

2.4 實驗組各部位骨密度變化

隨著染毒時間的增加，實驗組3個部位骨密度均呈下降趨勢，其下降程度：腰椎>股骨>脛骨。見圖2。

2.5 實驗組與對照組股骨骨密度變化情況比較

隨著染毒時間增加，在同一時間段內實驗組股骨骨密度下降程度比對照組骨快，見圖3。

2.6 實驗組與對照組腰椎骨密度變化情況比較

隨著染毒時間增加，同一時間段內實驗組腰椎骨密度下降程度比對照組快，見圖4。

2.7 實驗組與對照組脛骨骨密度變化情況比較

隨著染毒時間增加，在7月末實驗組和對照組脛骨骨密度較5月末均有下降，且實驗組骨密度下降程度比對照組快；在9月末實驗組與對照組脛骨密度均有所增加，且實驗組骨密度上升程度比對照組慢。見圖5。

3 討論

從19世紀40年代Albright提出絕經后骨質疏松與雌激素減少密切相關后，研究證實，雌激素水平的降低是絕經后骨質疏松發病的首要因素[8]。雌激素通過促進IL-6、IL-1產生及抑制骨吸收抑制因子的作用使破骨細胞形成增加和抑制TGF-β及IGF作用抑制骨形成等途徑使骨量減少[9]。已有研究[10]表明，在中國同一地區內絕經前婦女骨質疏松患病率(1.8%～3.2%)遠低于絕經后婦女患病率(9.4% ～ 37.9%)。本實驗采用雌性SD大鼠進行研究，去勢前PM2.5氣道滴注5月末測量實驗組與對照組骨密度變化，結果顯示實驗組與對照組脛骨、股骨和腰椎組間骨密度均未見明顯差異(表1)。對實驗組和對照組分別行去勢手術和假去勢手術后PM2.5持續氣道滴注4個月，再次測量BMD，結果顯示在相同PM2.5暴露時間下，去勢后SD大鼠腰椎、股骨和脛骨骨密度均較未去勢SD大鼠低(表2)，且隨著PM2.5氣道滴注時間的增加，卵巢去勢后雌性SD大鼠腰椎和股骨骨量的丟失速度顯著加快(圖3、圖4)。

臨床發現，不同骨骼部位骨量丟失的程度不同。絕經后骨質疏松癥所致的骨折常發生于脊柱、股骨頸和橈骨遠端等富含松質骨的部位，其中以腰椎最為常見。大量研究也表明，絕經后婦女腰椎部位骨量的變化最明顯。本研究結果顯示，在相同濃度PM2.5暴露下，去勢后大鼠腰椎骨密度下降程度比股骨和脛骨明顯(圖2)。當雌激素缺乏時，骨轉換增加，破骨細胞過于活躍，其功能相對或絕對增強，骨重建呈負平衡，引起骨量丟失，松質骨骨小梁豐富，其對雌激素缺乏所致的骨量丟失的敏感性大于皮質骨。本研究結果與文獻報道一致[11]。

目前我國社會老齡化越來越嚴重，而隨著老齡化人口所占比例的上升，PMOP的患者也正逐年增多，而空氣污染的進一步加重無疑是對PMOP患者病情的重大威脅。PMOP大大影響了絕經后婦女的生活質量，據調查，絕經后的5～10年是骨質疏松發生的高峰期，且發病率會隨著年齡增長而增高。所以為改善絕經后婦女骨質疏松及骨質疏松骨質發生，需要有效的預防措施，其中控制空氣污染正是關鍵措施之一。

本項目通過動物實驗來研究PM2.5懸濁液對絕經后SD大鼠骨密度變化的影響，證明環境中的PM2.5對絕經后骨質疏松具有一定的作用，但具體影響的機制有哪些，是怎樣的作用原理，需要進一步探究與證實。雖然大鼠骨質疏松的模型建立后出現的絕經后骨質疏松變化與人類相似，但大鼠的骨結構及代謝還是與人類的有所不同，且人類生存環境中空氣污染的程度不同，每個人的個體差異也均較實驗大鼠差異性大，所以如果能結合流行病調查研究本研究結果將更具有說服力。希望通過本研究能有更多的實驗來研究PM2.5對絕經后骨質疏松的影響；也希望能引起更多的人重視環境污染的問題，減少PM2.5的排放，來降低其對女性絕經后骨質疏松的影響，使女性絕經后生活質量得到更大的提升。