馬鞭草總苷對(duì)大鼠慢性前列腺炎/骨盆疼痛綜合征的改善作用及機(jī)制研究

李長(zhǎng)建，焦玉濤，王玉華，吳春磊

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院泌尿外科，河南新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，河南新鄉(xiāng) 453100）

慢性前列腺炎/骨盆疼痛綜合征（chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndrome，CP/CPPS）是成年男性常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)疾病，占慢性前列腺炎的90%以上，本病表現(xiàn)為不同程度的下尿路癥狀和性功能障礙，并伴有頑固持續(xù)性的盆腔會(huì)陰區(qū)域疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活[1-2]。馬鞭草（Verbena officinalisL.）為中醫(yī)臨床治療前列腺炎的常用中草藥，具有補(bǔ)腎益肝、利水消腫、潤(rùn)腸通便之功效[3]。馬鞭草主要活性成分——馬鞭草總苷對(duì)消痔靈誘導(dǎo)的慢性非細(xì)菌性前列腺炎（chronic nonbacterial protatitis，CNP）小鼠和大鼠模型均有較好的改善作用[4-5]，因此，馬鞭草總苷對(duì)CP/CPRS是否具有抗炎、鎮(zhèn)痛作用值得進(jìn)一步深入研究。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號(hào)通路與動(dòng)物體內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)和免疫調(diào)控密切相關(guān)，可通過(guò)調(diào)節(jié)炎性因子的活性廣泛參與慢性前列腺炎疼痛的發(fā)生與發(fā)展[6]。本研究建立CP/CPPS大鼠模型，觀察p38MAPK信號(hào)通路及輔助性T細(xì)胞（Th）1/Th2細(xì)胞平衡的變化，并進(jìn)一步探討馬鞭草總苷對(duì)CP/CPPS的抗炎、鎮(zhèn)痛作用及具體機(jī)制，以期為臨床上CP/CPPS的治療提供新的方法和依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠45只，8周齡，體質(zhì)量200~220 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：201912108，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2019-1-005。實(shí)驗(yàn)大鼠飼養(yǎng)及組織取材均于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫（23±2）℃，12 h循環(huán)明暗燈光，恒定濕度。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，自由飲水。

1.2 藥品與試劑馬鞭草總苷（總環(huán)烯醚萜苷含量為51.26%，批號(hào)：20190327），購(gòu)自江蘇南京青澤醫(yī)藥科技有限公司；吸附無(wú)細(xì)胞百白破聯(lián)合疫苗（批號(hào)：20190408-3）購(gòu)自武漢生物制品研究所；完全弗式佐劑，大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素8（IL-8）酶聯(lián)免疫吸咐分析（ELISA）試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗大鼠p38MAPK、p-p38MAPK多克隆抗體及基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 儀器IX73倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯光學(xué)有限公司；BD FACS Calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自Beckman公司；Von Frey纖維絲測(cè)痛儀購(gòu)自意大利Ugo Basile Srl公司；冷凍干燥機(jī)購(gòu)自松源華興有限公司；Chemi Doc XRS+System凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Multiskan Sky 450 nm酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 CP/CPPS大鼠模型的建立參考文獻(xiàn)研究[7]的方法制備前列腺蛋白提純液：處死5只雄性SD大鼠，剝離全部前列腺組織，加入等質(zhì)量的生理鹽水溶液制備成組織勻漿，低溫離心（15 000 r/min，離心半徑15 cm）30 min，收集上清，用冷凍干燥，機(jī)制備成凍干粉末（-80℃保存），臨用前與適量生理鹽水混合，制成1.0 mg/mL的前列腺蛋白提純液。參考文獻(xiàn)研究[8]的方法制備CP/CPPS大鼠模型：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，在實(shí)驗(yàn)的第0、7、14、28天，用10 g/L戊巴比妥鈉腹腔麻醉，于大鼠盆腔區(qū)域皮下及雙側(cè)肩胛皮下多點(diǎn)（≥6）注射前列腺蛋白提純液和完全弗氏佐劑（1∶1 200 μL），同時(shí)，腹腔注射0.5 mL百白破疫苗[8]。

1.5 動(dòng)物分組與給藥方法將造模成功的32只CP/CPPS模型大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為模型對(duì)照組，馬鞭草總苷低、中、高劑量組，每組8只，另設(shè)8只正常大鼠作為空白對(duì)照組。在建模第30天開(kāi)始進(jìn)行馬鞭草總苷的干預(yù)，連續(xù)22 d，每日1次。馬鞭草總苷低、中、高劑量組分別對(duì)應(yīng)灌胃30、60、120 mg·kg-1的馬鞭草總苷[4]，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組則灌胃等體積的生理鹽水。末次給藥后的第2天，進(jìn)行后續(xù)相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

1.6 觀察指標(biāo)與方法

1.6.1 機(jī)械性異常痛敏測(cè)定末次給藥后的第2天，參考文獻(xiàn)研究[9]的方法，用Von Frey纖維絲測(cè)痛儀測(cè)定各組大鼠機(jī)械性痛閾。安靜環(huán)境下，將大鼠放置在疼痛檢測(cè)鋼絲籠內(nèi)，在適應(yīng)10 min后，用Von Frey纖維絲垂直刺激其骨盆區(qū)域10次，每次進(jìn)行10 s，2次刺激間隔20 s，刺激程度由輕及重（0.008~4 g），待大鼠表現(xiàn)出立即舔或抓蹭刺激區(qū)域、腹部急劇收縮或跳躍等陽(yáng)性反應(yīng)時(shí)，記錄測(cè)痛儀的壓力值，即為痛反應(yīng)閾值（g）。

1.6.2 前列腺指數(shù)測(cè)定末次給藥后第2天，各組大鼠禁食后稱定體質(zhì)量，處死大鼠，剝離前列腺組織并準(zhǔn)確稱質(zhì)量，計(jì)算前列腺指數(shù)（前列腺指數(shù)=前列腺濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）。

1.6.3 前列腺組織病理檢查將上述獲取的前列腺組織參考文獻(xiàn)研究[10]的方法制備病理學(xué)切片。用體積分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液固定24 h，二甲苯透明，石蠟包埋，蘇木素-伊紅染色后，在顯微鏡下觀察前列腺標(biāo)本的組織病理學(xué)改變，分析各組大鼠前列腺的腺體結(jié)構(gòu)、導(dǎo)管以及腺體周圍間質(zhì)的差異。

1.6.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血Th1、Th2淋巴細(xì)胞百分比參考文獻(xiàn)研究[11]的方法將獲得的外周血進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、活化及細(xì)胞表面抗原標(biāo)記、破膜及胞內(nèi)細(xì)胞因子染色。方法：100 μL外周血加入100 μL RPMI 1640培養(yǎng)液、刺激劑佛醇乙酯（PMA）（25 ng/mL）和離子霉素（Ion-omycin）（1 μg/mL），隨后加入蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)阻斷劑藍(lán)菌素A（BFA）（10 μg/mL），混勻后在體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)4 h，各加入CD3-PC5和CD8-FITC進(jìn)行標(biāo)記。加入Fix&Perm破膜劑分別固定、破膜和溶血。加入抗大鼠IFN-γ PE、IL-4 PE進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，隨后上機(jī)檢測(cè)。使用CD3+CD8-設(shè)門來(lái)圈定CD4+T細(xì)胞群，在收集1×104個(gè)細(xì)胞后，使用Cellquest軟件分析得出Th1（CD3+CD8-/IFNγ+）和Th2（CD3+CD8-/IL-4+）的百分比及相應(yīng)細(xì)胞分布。

1.6.5 ELISA法檢測(cè)前列腺組織TNF-α、IL-1β及IL-8含量將上述獲取的前列腺組織參考文獻(xiàn)研究[12]的方法制備前列腺組織勻漿，4℃離心（3 000 r/min，離心半徑15 cm）15 min，分離上清，嚴(yán)格按照TNF-α、IL-1β、IL-8試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟操作，最后應(yīng)用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)光密度值，計(jì)算各指標(biāo)含量。

1.6.6 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測(cè)前列腺組織總p38MAPK、p-p38MAPK及MMP-9的表達(dá)取前列腺組織，參考文獻(xiàn)研究[13]的方法制備前列腺組織勻漿，提取總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒進(jìn)行蛋白定量。繼而常規(guī)上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，兔抗鼠MMP-9單克隆一抗（1∶100稀釋）、p38MAPK（1∶100稀釋）多克隆一抗和p-p38MAPK（1∶100稀釋）多克隆一抗孵育及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)志鼠抗兔二抗（1∶2 000稀釋）孵育，化學(xué)底物發(fā)光法顯色，圖像掃描分析，最后應(yīng)用Image-QuaNT軟件測(cè)量其光密度，以各β-actin為內(nèi)參對(duì)照分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠前列腺組織病理變化比較圖1結(jié)果顯示：空白對(duì)照組大鼠前列腺組織結(jié)構(gòu)完整清晰，未見(jiàn)水腫、充血，腺腔和間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺泡間纖維分布正常；模型對(duì)照組大鼠前列腺組織出現(xiàn)了嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)紊亂，可見(jiàn)明顯的水腫和充血，腺腔內(nèi)分泌物明顯減少，腺腔和間質(zhì)內(nèi)有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腺腔壁上皮細(xì)胞明顯增生；馬鞭草總苷低劑量組大鼠前列腺組織可見(jiàn)輕微損傷破壞，可見(jiàn)水腫和充血，腺腔和間質(zhì)內(nèi)有中等量的纖維增生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；馬鞭草總苷中劑量組大鼠前列腺組織未見(jiàn)明顯損傷破壞，未見(jiàn)水腫和充血，但腺腔和間質(zhì)內(nèi)有少量的纖維增生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；馬鞭草總苷高劑量組大鼠前列腺組織同樣未見(jiàn)明顯的損傷破壞、水腫和充血，整個(gè)前列腺基底膜較為完整，腺腔和間質(zhì)未有纖維增生，但可見(jiàn)較少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖1 各組大鼠前列腺組織病理變化比較（HE染色法，×200）Figure 1 Comparison of histopathological changes of prostate tissues in various groups of rats（by HE staining，×200）

2.2 各組大鼠前列腺指數(shù)、機(jī)械痛閾值比較表1結(jié)果顯示：前列腺指數(shù)與機(jī)械痛閾值各組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠前列腺指數(shù)顯著增加（P＜0.05），機(jī)械痛閾值顯著降低（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，馬鞭草總苷低、中、高劑量組的前列腺指數(shù)顯著降低（P＜0.05）、機(jī)械痛閾值均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），且呈劑量依賴性。

表1 各組大鼠前列腺指數(shù)、機(jī)械痛閾值比較Table 1 Comparison of prostate index and mechanical pain threshold in various groups of rats（±s）

表1 各組大鼠前列腺指數(shù)、機(jī)械痛閾值比較Table 1 Comparison of prostate index and mechanical pain threshold in various groups of rats（±s）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白對(duì)照組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型對(duì)照組比較

前列腺指數(shù)/（mg?g-1）2.05±0.18 3.57±0.26①3.14±0.31①③2.52±0.24①③2.27±0.21③4.569 0.023機(jī)械痛閾值/g 71.22±6.75 41.57±3.98②47.59±4.41②③54.66±4.69②③66.78±5.38①④6.583 0.008組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組馬鞭草總苷低劑量組馬鞭草總苷中劑量組馬鞭草總苷高劑量組F值P值鼠數(shù)/只8 8 8 8 8

2.3 各組大鼠前列腺組織TNF-α、IL-1β及IL-8含量比較表2結(jié)果顯示：TNF-α、IL-1β及IL-8含量各組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的TNF-α、IL-1β及IL-8含量均顯著增加（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，馬鞭草總苷低、中、高劑量組的TNF-α、IL-1β及IL-8含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），且呈劑量依賴性。

表2 各組大鼠前列腺組織TNF-α、IL-1β及IL-8含量比較Table 2 Comparison of contents of TNF-α，IL-1β and IL-8 in the prostate tissues in various groups of rats （±s，ng·g-1 prot）

表2 各組大鼠前列腺組織TNF-α、IL-1β及IL-8含量比較Table 2 Comparison of contents of TNF-α，IL-1β and IL-8 in the prostate tissues in various groups of rats （±s，ng·g-1 prot）

①P＜0.05，②P＜0.01，與空白對(duì)照組比較；③P＜0.05，④P＜0.01，與模型對(duì)照組比較

組別空白對(duì)照組模型對(duì)照組馬鞭草總苷低劑量組馬鞭草總苷中劑量組馬鞭草總苷高劑量組F值P值IL-8 7.25±0.68 18.65±1.57②15.43±1.09①③11.74±0.84①③8.41±0.73③13.457 0.003鼠數(shù)/只8 8 8 8 8 TNF-α 17.32±3.52 35.42±3.73②30.42±3.36②③23.28±2.91①③19.47±2.21④6.283 0.009 IL-1β 23.46±2.68 47.35±3.75②40.68±3.09②③33.81±2.69②③26.59±1.98①④18.662<0.001

2.4 各組大鼠前列腺組織p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較圖2、表3結(jié)果顯示：p38MAPK蛋白相對(duì)表達(dá)量各組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但p-p38MAPK、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-p38MAPK/p38MAPK比值組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組的p-p38MAPK、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-p38MAPK/p38MAPK比值均顯著增加（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，馬鞭草總苷低、中、高劑量組的p-p38MAPK、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-p38MAPK/p38MAPK比值均顯著降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表3 各組大鼠前列腺組織p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較Table 3 Comparison of expression of p38MAPK signaling pathway-related proteins in prostate tissues of various groups of rats （x±s）

圖2 各組大鼠前列腺組織p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白Western Blot電泳條帶Figure 2 Western Blot electrophoretic bands of p38MAPK signaling pathway-related proteins in prostate tissues in various groups of rats

2.5 各組大鼠外周血Th1、Th2淋巴細(xì)胞百分比及Th1/Th2比值的比較表4結(jié)果顯示：Th1淋巴細(xì)胞百分比及Th1/Th2比值各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與空白對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠Th1淋巴細(xì)胞百分比及Th1/Th2比值顯著升高（P＜0.05），Th2淋巴細(xì)胞百分比顯著降低（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，馬鞭草總苷低、中、高劑量組的Th1淋巴細(xì)胞百分比及Th1/Th2比值顯著降低（P＜0.05），Th2淋巴細(xì)胞百分比顯著升高（P＜0.05），且呈劑量依賴性。

表4 各組大鼠外周血Th1、Th2淋巴細(xì)胞百分比及Th1/Th2比值的比較Table 4 Comparison of Th1，Th2 lymphocyte percentage and Th1/Th2 ratio in peripheral blood in various groups of rats （x±s）

3 討論

慢性前列腺炎/骨盆疼痛綜合征（CP/CPPS）是慢性前列腺炎的常見(jiàn)類型，臨床主要以改善排尿不暢、緩解疼痛、提高患者生活質(zhì)量為主[14]。馬鞭草總苷為馬鞭草中的主要活性成分。在本研究中，馬鞭草總苷對(duì)CP/CPPS模型大鼠干預(yù)后，可顯著保護(hù)前列腺組織，減少前列腺的纖維增生及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)可明顯降低模型大鼠的前列腺指數(shù)，不同程度地改善前列腺增大的癥狀。這表明馬鞭草總苷對(duì)CP/CPPS具有較好的改善作用。陰部或前列腺區(qū)域酸脹痛甚至劇痛是困擾CP/CPPS綜合征患者的主要問(wèn)題，在臨床一直備受重視[15]。在本研究中，馬鞭草總苷的干預(yù)可明顯提高CP/CPPS模型大鼠的機(jī)械痛閾值，表明馬鞭草總苷能夠有效緩解CP/CPPS的疼痛癥狀。預(yù)測(cè)臨床應(yīng)用馬鞭草可能可以有效克服CP/CPPS患者伴隨的持續(xù)性、難治性的疼痛問(wèn)題，故對(duì)此作用及機(jī)制我們做了進(jìn)一步的探討。

有研究表明，在Ⅲ型前列腺炎患者的前列腺液中均發(fā)現(xiàn)了IL-1β、TNF-α等炎癥因子的升高，認(rèn)為該炎性細(xì)胞因子參與了CP/CPPS的病理進(jìn)展，其表達(dá)水平與CP/CPPS患者的病理性疼痛等問(wèn)題密切相關(guān)[16]。在本研究中，馬鞭草總苷的干預(yù)能夠明顯減少CP/CPPS模型大鼠前列腺組織中TNF-α、IL-1β及IL-8炎性因子的含量，并且隨著劑量的增加，降低作用更明顯，這與上述馬鞭草總苷改善CP/CPPS模型大鼠前列腺病理進(jìn)程及疼痛閾值結(jié)果相一致。p38 MAPK信號(hào)通路廣泛參與了動(dòng)物體內(nèi)的應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，有研究表明，炎癥因子TNF-α作為p38 MAPK信號(hào)通路的上游啟動(dòng)因子可激活p38 MAPK信號(hào)通路，使其磷酸化水平提高，繼而又加劇炎性因子和MMP-9的表達(dá)，造成前列腺炎組織進(jìn)一步損害[17-18]。在本研究中，馬鞭草總苷干預(yù)后，CP/CPPS模型大鼠前列腺組織MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量及p-p38MAPK/p38MAPK比值均顯著降低，表明馬鞭草總苷抑制了p38MAPK蛋白的磷酸化，其可通過(guò)調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路降低炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而改善CP/CPPS的炎癥反應(yīng)和疼痛。

自身免疫和T細(xì)胞增殖反應(yīng)參與了CP/CPPS的病理進(jìn)程，T細(xì)胞亞群（Th1/Th2）之間的相互協(xié)調(diào)對(duì)于維持男性泌尿生殖系統(tǒng)的正常免疫平衡尤為重要，Th1細(xì)胞分泌的IFNγ可抑制Th2類細(xì)胞因子的產(chǎn)生，而Th2細(xì)胞分泌的IL-4則能夠下調(diào)Th1細(xì)胞的功能[15，19]。在本研究中，馬鞭草總苷干預(yù)后，CP/CPPS模型大鼠外周血Th1淋巴細(xì)胞百分比及Th1/Th2比值顯著降低，表明馬鞭草總苷能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群比例，對(duì)CP/CPPS過(guò)程中的Th1/Th2漂移起到恢復(fù)作用。

綜上所述，馬鞭草總苷能有效降低CP/CPPS模型大鼠的前列腺指數(shù)。抑制炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與下調(diào)p38MAPK信號(hào)通路相關(guān)調(diào)控蛋白和調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞亞群比例有關(guān)。本研究初步探究了馬鞭草總苷治療CP/CPPS的抗炎、鎮(zhèn)痛作用，顯示馬鞭草總苷臨床治療CP/CPPS有一定的應(yīng)用前景。