冠心病病人外周血sCD14、TLR4表達(dá)與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系

李海龍，林英子

冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病又稱冠心病，主要是由冠狀動(dòng)脈狹窄造成機(jī)體供血不足引起的心肌功能障礙[1]。冠心病病人冠狀動(dòng)脈血管易形成粥樣硬化，出現(xiàn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，但冠狀動(dòng)脈中斑塊易發(fā)生破裂、出血。冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是否穩(wěn)定及其形態(tài)與冠狀動(dòng)脈疾病發(fā)生有密不可分的關(guān)系[2]。有文獻(xiàn)報(bào)道，炎癥反應(yīng)在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定中起著重要作用[3]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是一類介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的受體家族。有研究顯示，TLR4可激活核因子κB(NF-κB)，導(dǎo)致大量炎性因子[如腫瘤壞死因子α(TNF-α)]產(chǎn)生[4]。白細(xì)胞分化抗原14(CD14)是機(jī)體炎癥反應(yīng)顯著的標(biāo)志物。血清中CD14以可溶性CD14(soluble CD14，sCD14)形式存在。已有研究報(bào)道sCD14可在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用[5]。本研究將觀察不同類型冠心病病人外周血TLR4和sCD14表達(dá)水平，并分析TLR4和sCD14與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年10月—2020年2月我院心血管內(nèi)科收治的冠心病病人146例(冠心病組)，男102例，女44例；年齡50～80(63.25±8.72)歲；疾病類型：穩(wěn)定型心絞痛(SAP)38例，不穩(wěn)定型心絞痛(UAP)55例，急性心肌梗死(AMI)53例。冠心病病人納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合世界衛(wèi)生組織關(guān)于冠心病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]，經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影(coronary angiography，CAG)檢查，至少有1支冠狀動(dòng)脈狹窄程度≥50%；②靜息型心絞痛持續(xù)時(shí)間≥20 min；③心絞痛發(fā)作時(shí)心電圖出現(xiàn)ST段改變，發(fā)作暫停后，ST段迅速恢復(fù)正常；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①嚴(yán)重肝、腎、心功能不全者；②伴有惡性腫瘤者；③伴有全身性免疫疾病者；④近2個(gè)月內(nèi)有手術(shù)史；⑤合并先天性心臟病、風(fēng)濕性心臟病、肺源性心臟病；⑥凝血功能障礙者。依據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，根據(jù)CT冠狀動(dòng)脈成像將冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊分為軟斑塊(-40～50 Hu)、混合型斑塊(各種成分均有)、硬斑塊(>120 Hu)，由2名有經(jīng)驗(yàn)的放射科醫(yī)師共同判讀。選取同期體檢健康者146名為對(duì)照組，其中，男95名，女51名；年齡45～80(63.68±9.21)歲。本研究受試者均知情同意，并簽署臨床研究協(xié)議書，且經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，符合《世界醫(yī)學(xué)大會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集 冠心病病人入院時(shí)采集靜脈血5～6 mL，對(duì)照組在體檢當(dāng)天采集靜脈血5～6 mL，一份裝于采血管中，4 ℃、4 000 r/min離心10 min，留上清，凍存于-80 ℃冰箱中，待測(cè)；另一份裝于含乙二胺四乙酸(EDTA)采血管中，直接凍存于-80 ℃冰箱中，待測(cè)。

1.2.2 sCD14水平檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清中sCD14水平，人sCD14 ELISA試劑盒(貨號(hào)：110-01)購自南京賽泓瑞生物科技有限公司。

1.2.3 外周血TLR4檢測(cè) 取出凍存血液樣品，解凍，設(shè)置實(shí)驗(yàn)管和同型對(duì)照管。向試管中加入等體積的紅細(xì)胞裂解液，3 000 r/min離心5 min，棄上清。向試管中加入等體積的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋試管中成分，離心5 min，向?qū)嶒?yàn)管中加入5 μL藻紅蛋白(PE)鼠抗人TLR4(CD284)和APC鼠抗人CD14抗體，向同型對(duì)照管加入鼠免疫球蛋白G1和APC鼠抗人CD14抗體。混勻，靜置15 min，離心，留細(xì)胞沉淀，加入固定劑溶液1 mL，混勻，用流式細(xì)胞儀ProCOUNT軟件檢測(cè)TLR4陽性率。

1.3 臨床資料收集 收集所有研究對(duì)象體質(zhì)指數(shù)(BMI)、既往病史、尿常規(guī)(尿素氮、尿肌酐)及生化檢測(cè)結(jié)果。采用日立7600-20生化全自動(dòng)分析儀檢測(cè)研究對(duì)象血清中三酰甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density liptein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein，LDL-C)、總膽固醇(total cholesterol，TC)水平。

1.4 Gensini評(píng)分評(píng)定 使用Gensini評(píng)分評(píng)估病人冠狀動(dòng)脈病變程度。Gensini評(píng)分的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)參考文獻(xiàn)[8]，分值越高，冠狀動(dòng)脈狹窄程度越嚴(yán)重。

2 結(jié) 果

2.1 各組臨床資料比較 各組性別、年齡、BMI、糖尿病、高血壓、尿素氮、肌酐、TG、TC、HDL-C、LDL-C比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與SAP組比較，AMI組、UAP組Gensini評(píng)分升高(P<0.05)；與UAP組相比，AMI組Gensini評(píng)分升高(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組臨床資料比較

2.2 各組外周血sCD14、TLR4表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，SAP組、AMI組、UAP組sCD14、TLR4表達(dá)水平升高(P<0.05)；與SAP組比較，AMI組、UAP組sCD14、TLR4表達(dá)水平升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組外周血sCD14、TLR4表達(dá)水平比較(±s)

2.3 不同成分斑塊組外周血sCD14、TLR4表達(dá)水平比較 軟斑塊組52例，混合型斑塊組48例，硬斑塊組46例。與硬斑塊組比較，軟斑塊組、混合型斑塊組sCD14、TLR4表達(dá)水平升高(P<0.05)；與混合型斑塊組比較，軟斑塊組sCD14、TLR4表達(dá)水平升高(P<0.05)。詳見表3。

表3 不同成分斑塊組外周血sCD14、TLR4表達(dá)水平比較(±s)

2.4 冠心病病人外周血sCD14、TLR4表達(dá)水平與Gensini評(píng)分的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，sCD14、TLR4表達(dá)水平均與Gensini評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)。詳見表4。

表4 冠心病病人外周血sCD14、TLR4表達(dá)水平與Gensini評(píng)分的相關(guān)性

2.5 Logistic回歸分析冠心病病人冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的影響因素 以冠心病病人冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是否穩(wěn)定為因變量，以入院Gensini評(píng)分、sCD14、TLR4為自變量，Logistic回歸分析結(jié)果顯示，高水平TLR4、高水平sCD14、高Gensini評(píng)分是冠心病病人冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。詳見表5。

表5 Logistic回歸分析冠心病病人冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的影響因素

3 討 論

炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制。冠心病病人一旦發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂，會(huì)加重病情，而斑塊破裂是在斑塊不穩(wěn)定性時(shí)發(fā)生的[9]。斑塊成分復(fù)雜，硬斑塊屬于穩(wěn)定斑塊，軟斑塊屬于不穩(wěn)定斑塊，混合型斑塊介于穩(wěn)定與不穩(wěn)定斑塊之間。斑塊穩(wěn)定性一定程度上可影響冠心病的病情發(fā)展[10]，及早預(yù)測(cè)斑塊穩(wěn)定性對(duì)預(yù)估冠心病病人病情具有重大意義。TLR4基因位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂(9q33.1)上，編碼的蛋白在病原體識(shí)別和天然免疫激活中起著基礎(chǔ)性作用。研究證實(shí)TLR4與配體結(jié)合后形成二聚體，進(jìn)而啟動(dòng)下游炎癥反應(yīng)；另外，在免疫細(xì)胞合成TLR4后，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活NF-κB，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子(如TNF-α)[11]。徐凱等[12]研究發(fā)現(xiàn)，急性冠脈綜合征病人外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平明顯高于正常體檢者，且AMI病人外周血TLR4表達(dá)水平高于SAP病人，3支冠狀動(dòng)脈病變病人明顯高于單支、雙支冠狀動(dòng)脈病變病人。本研究發(fā)現(xiàn)AMI組和UAP組外周血TLR4表達(dá)水平明顯高于SAP組和對(duì)照組，SAP組外周血TLR4表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，提示TLR4可能參與冠心病的發(fā)生過程。本研究中AMI組和UAP組外周血TLR4表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，與徐凱等[12]研究結(jié)果不同，可能是因?yàn)楸狙芯繕颖玖枯^小，研究結(jié)果存在偏倚。本研究發(fā)現(xiàn)軟斑塊組TLR4表達(dá)水平高于硬斑塊組、混合型斑塊組，混合型斑塊組TLR4表達(dá)水平高于硬斑塊組，提示TLR4可能與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān)，推測(cè)TLR4可能促進(jìn)斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定、破裂。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TLR4與Gensini評(píng)分呈正相關(guān)，提示TLR4水平變化可能與冠狀動(dòng)脈病變程度相關(guān)。

CD14可分為兩大類，一類是膜結(jié)合型(mCD14)，位于單核、巨噬等細(xì)胞的細(xì)胞膜上；一類是sCD14，存在于機(jī)體外周血中。CD14受體位于多形核細(xì)胞，如單核、巨噬等細(xì)胞的細(xì)胞膜上。已經(jīng)證明CD14在炎癥中起作用，其與受體相互作用后，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，并促進(jìn)全身性炎癥反應(yīng)，可能是監(jiān)測(cè)炎癥的有價(jià)值參數(shù)[13]。Carron等[14]發(fā)現(xiàn)慢性腎臟疾病可進(jìn)展為終末期腎病，此過程與持續(xù)的低度炎癥及腸道細(xì)菌有關(guān)，炎癥及腸道細(xì)菌會(huì)使腸道上皮屏障破損，進(jìn)而細(xì)菌產(chǎn)物脂多糖(LPS)可攜帶CD14從腸腔轉(zhuǎn)移到外周血中，使病人外周血中sCD14濃度升高。王磊等[15]發(fā)現(xiàn)血清中sCD14水平在由炎癥反應(yīng)引起的心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的心房顫動(dòng)病人中明顯升高。本研究發(fā)現(xiàn)AMI組、UAP組sCD14表達(dá)水平高于SAP組和對(duì)照組，SAP組sCD14、TLR4表達(dá)水平高于對(duì)照組，提示sCD14可能參與冠心病的發(fā)生及發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)軟斑塊組sCD14表達(dá)水平高于硬斑塊組、混合型斑塊組，混合型斑塊組sCD14表達(dá)水平高于硬斑塊組，提示sCD14可能與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形態(tài)有關(guān)，推測(cè)sCD14可能通過促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)影響斑塊穩(wěn)定性。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)sCD14與Gensini評(píng)分呈正相關(guān)，提示sCD14水平變化可能影響冠狀動(dòng)脈病變程度。Logistic回歸分析顯示，高水平TLR4、高水平sCD14、高Gensini評(píng)分是冠心病病人冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的危險(xiǎn)因素，提示通過檢測(cè)TLR4、sCD14表達(dá)水平有助于判斷冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊是否穩(wěn)定。

綜上所述，冠心病病人外周血TLR4表達(dá)水平及血清sCD14水平明顯上調(diào)，二者在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成及斑塊不穩(wěn)定性中可能發(fā)揮重要作用。