外源褪黑素不同浸種濃度和時長對干旱脅迫下無芒雀麥種子萌發的影響

肖珍珍， 隋曉青*， 石國慶， 陳愛萍， 烏 蘭， 張 博*

(1. 新疆農業大學草業學院， 西部干旱荒漠區草地資源與生態教育部重點實驗室， 新疆草地資源與生態重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052； 2. 烏蘇市林草局， 新疆 烏蘇 833000)

隨著全球氣溫升高，干旱和半干旱區水分缺乏和干旱危害日趨加劇，植物的生長發育被嚴重影響[1]。種子發芽以及幼苗生長是植物整個生命活動的起點，也是其適應外部環境的端點，更是植物生長的敏感時期[2]，這一時期干旱脅迫會直接影響到自然種群定殖和人工種群的田間出苗率[3-5]，從而關系到種群能否建植成功。近年來，植物激素浸種處理已逐步應用于農業生產中，通過激活種胚的新陳代謝促進脅迫條件下種子的出苗率和出苗齊性，在棉花(Gossypiumhirsutum)、大豆(Glycinemax)、小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)等農作物種子研究中得到了很好的驗證[6-9]；在草種方面也開展了部分研究，如經褪黑素(melatonin，MT)浸種的黑麥草(Loliumperenne)種子在干旱環境中可不同程度地提高其發芽率[10]，在紫花苜蓿上(Medicagosativa)外源噴施適宜濃度的MT，可以提高紫花苜蓿在干旱脅迫條件下的抗氧化酶活性，抑制氧化傷害從而提高其抗旱性,也可增強氮代謝相關酶的活性，促進氮代謝過程[11]。這些研究結果顯示出MT在增強植物抗旱能力方面的獨特作用，也進一步表明在逆境下采用激素處理，對促進旱區植物種子萌發及幼苗建成具有潛在應用前景[12]。

MT(N-乙酰-5-甲氧基色胺)是普遍存在于動植物體內的一種低分子量(232.27)吲哚胺類化合物，當前其在植物中的應用已成為植物抗逆性研究的一個相關課題[13]。最近，MT在干旱脅迫、釩脅迫、鹽脅迫等條件下對植物的緩解作用得到證實[14-20]。研究表明MT在種子萌發中起重要作用[21]，但不同的種質采取MT處理的濃度和時間不盡相同，如在棉花種子中低濃度MT(20 μmol·L-1)能夠促進萌發，而高濃度則降低了種子的萌發率[22]。在蕎麥(Fagopyrumesculentum)種子中200 μmol·L-1MT浸種12 h能夠顯著提高150 mmol·L-1鹽脅迫下種子的發芽率和發芽勢[23]。大豆種子的芽長、發芽率、發芽指數及生物量在鹽堿脅迫下通過100 μmol·L-1MT浸種處理8 h被顯著提高[24]。李本峰等[10]研究發現不同濃度MT浸種12 h會顯著提高PEG脅迫下多年生黑麥草種子的發芽勢和發芽率。而在中旱生無芒雀麥(Bromusinermis)種子萌發中MT是否對干旱脅迫存在緩解效應？如果存在，那么適宜的處理濃度和時長是多少？目前還未見相關報道。

無芒雀麥是禾本科雀麥屬的一個種，屬于多年生冷季型長壽牧草，是重要的護坡和水土保持植物[25]，在我國北方干旱半干旱地區具有重要的栽培應用價值，是天然草地補播和人工草場建植的重要草種[26]。目前，關于不同濃度外源MT浸種對無芒雀麥種子萌發的抗旱效應尚缺乏相關評價，基于此，本研究以烏蘇1號無芒雀麥(Bromusinermiscv. Wusu No.1)為研究對象，探究干旱脅迫下MT浸種處理后的種子萌發效應，篩選促進無芒雀麥種子萌發的最佳浸種濃度及時長，為干旱半干旱區無芒雀麥建植生產提供可行操作方法，同時為外源MT緩解無芒雀麥及其他禾本科草種干旱脅迫的生理機制研究提供理論依據與借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選用烏蘇1號無芒雀麥為試驗材料，該材料來源于新疆烏蘇市草原站林草局，經檢測發芽率為89.20%。褪黑素(MT)購自北京索萊寶科技有限公司，聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG-6000)購自天津市致遠化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

選擇成熟、飽滿的無芒雀麥種子為萌發材料，種子用75%酒精浸泡消毒30 s，蒸餾水沖洗3次，每次2 min，自然晾干。將種子分組避光浸沒于0 μmol·L-1，25 μmol·L-1，50 μmol·L-1，75 μmol·L-1，100 μmol·L-1和200 μmol·L-1MT溶液中，浸種時長分別為12 h，24 h，48 h。用PEG模擬干旱脅迫，根據前期的預試驗結果，設定PEG濃度為23%。種子處理包括：PEG+0 μmol·L-1MT處理、PEG+25 μmol·L-1MT處理、PEG+50 μmol·L-1MT處理、PEG+75 μmol·L-1MT處理、PEG+100 μmol·L-1MT處理、PEG+200 μmol·L-1MT處理，以施加蒸餾水為CK組。將浸種處理后的種子分別均勻播入培養皿內(φ9 cm)，培養皿內鋪兩層濾紙，每皿播100粒，分別加入6 mL處理液，每個處理重復4次。將所有培養皿置于培養箱中發芽(光周期16 h/8 h，晝溫25℃，夜溫15℃)。每天記錄種子的萌發數。種子發芽過程中，每日用天平稱量培養皿重量，補充去離子水使培養皿達到原重量，從而使PEG溶液濃度保持不變。

1.3 測定指標及方法

種子發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數參考孫可萌等[27]的計算方法。4次重復中有1粒種子萌發，即為發芽起始，之后每24 h統計1次發芽種子數，以胚根突破種皮2 mm作為發芽標準。在發芽7 d后計算發芽勢，14 d后計算發芽率、發芽指數和活力指數。

發芽指數= Σ(Gt/Dt)，式中：Gt表示在t時間內的發芽數目，Dt為相應的發芽天數。

活力指數=SH×Σ(Gt/Dt)，式中：SH為發芽結束時種子的平均胚芽長。

1.4 無芒雀麥萌發期抗旱性綜合評價

參考Fang等[28]和段利萍等[29]的方法，用模糊數學中隸屬函數法建立綜合評價體系，分析種子在萌發期應對干旱脅迫的能力。不同濃度外源MT浸種處理種子后，通過建立綜合評價體系，用某一指標的均值反映無芒雀麥種子萌發的抗旱效應，系統地評價MT浸種處理后無芒雀麥種子在萌發期的抗旱能力。評價體系中有關隸屬函數及權重等的計算方法如下：

(1)

(2)

(3)

(4)

(5)

1.5 數據分析

數據使用Excel 2010錄入，采用SPSS 19.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 褪黑素浸種對干旱脅迫下無芒雀麥種子萌發的影響

如表1所示，浸種12 h處理下，蒸餾水(0 μmol·L-1MT)浸種的無芒雀麥種子在干旱脅迫下發芽率為70.67%，較CK顯著降低(P<0.05)，而不同濃度MT處理后無芒雀麥種子的平均發芽率均較0 μmol·L-1MT浸種有所提高。0 μmol·L-1MT浸種的無芒雀麥種子在干旱脅迫下發芽勢比CK降低了55.39%(P<0.05)；25,75,100,200 μmol·L-1處理后發芽勢均較0 μmol·L-1MT浸種提高了15.83%，10.83%，38.33%和6.67%(P>0.05),50 μmol·L-1MT處理后發芽勢較0 μmol·L-1MT浸種提高了40%(P<0.05)。0 μmol·L-1MT浸種的無芒雀麥種子在干旱脅迫下發芽指數較CK顯著降低(P<0.05)，而不同濃度MT處理后無芒雀麥種子的發芽指數較0 μmol·L-1MT浸種均有所提高(P>0.05)。0 μmol·L-1MT浸種的無芒雀麥種子在干旱脅迫下活力指數比對照降低了72.46% (P<0.05)，MT濃度由低到高處理后種子活力指數分別較0 μmol·L-1MT浸種提高了35.71%，64.22%，29.10%，38.66%和40.19%。0 μmol·L-1MT浸種的無芒雀麥種子在干旱脅迫下胚芽長較CK顯著降低(P<0.05)，當添加外源MT后胚芽長較0 μmol·L-1MT浸種處理有所升高，但不同濃度MT處理組之間的胚芽長差異不顯著(P>0.05)。

表1 褪黑素浸種對無芒雀麥種子萌發指標的影響Table 1 Effect of melatonin immersion on seed germination indexes of Bromus inermis

浸種24 h處理下，0 μmol·L-1MT浸種的無芒雀麥種子在干旱脅迫下發芽率為61.33%，較CK(95.67%)顯著降低(P<0.05)，而50 μmol·L-1，75 μmol·L-1，100 μmol·L-1，200 μmol·L-1MT處理后無芒雀麥種子的發芽率較0 μmol·L-1MT浸種顯著提高(P<0.05)。0 μmol·L-1MT浸種的無芒雀麥種子在干旱脅迫下發芽勢比CK降低了59.32%(P<0.05)，除低濃度MT處理外，其他濃度MT處理后種子的發芽勢較0 μmol·L-1MT浸種處理顯著提高(P<0.05)。0 μmol·L-1MT浸種的無芒雀麥種子在干旱脅迫下發芽指數、活力指數較CK顯著降低(P<0.05)，而不同濃度MT處理后無芒雀麥種子的發芽指數及活力指數除低濃度處理外其他處理均較0 μmol·L-1MT浸種處理顯著提高(P<0.05)。0 μmol·L-1MT浸種的無芒雀麥種子在干旱脅迫下胚芽長較CK顯著降低(P<0.05)，外源MT處理后胚芽長較0 μmol·L-1MT浸種處理均有所增高，但不同濃度MT處理組之間的胚芽長差異不顯著(P>0.05)。

浸種48 h處理下，0 μmol·L-1MT浸種的無芒雀麥種子在干旱脅迫下發芽率為72.33%，較CK(92.50%)顯著降低(P<0.05)，而25 μmol·L-1，50 μmol·L-1，75 μmol·L-1，100 μmol·L-1MT處理后無芒雀麥種子的發芽率均較0 μmol·L-1MT浸種提高了18.90%，26.27%，22.59%，25.35%(P<0.05)。0 μmol·L-1MT浸種的無芒雀麥種子在干旱脅迫下發芽勢比CK降低了50.43%(P<0.05)；不同濃度MT處理組之間的發芽勢差異不顯著(P>0.05)。0 μmol·L-1MT浸種的無芒雀麥種子在干旱脅迫下發芽指數、活力指數及胚芽長較CK顯著降低(P<0.05)，而不同濃度MT處理組之間的發芽指數、活力指數及胚芽長差異不顯著(P>0.05)。

浸種時長和浸種濃度互作對各處理間胚芽長無顯著影響，但對發芽率、發芽勢、發芽指數及活力指數具有顯著影響，發芽率以0 μmol·L-1，25 μmol·L-1MT浸種48 h較好，顯著高于24 h處理(P<0.05)；發芽勢以100 μmol·L-1，200 μmol·L-1MT浸種24 h較好，顯著高于其他浸種時長處理(P<0.05)；發芽指數以50,100,200 μmol·L-1MT浸種24 h較好，顯著高于其他浸種時長處理(P<0.05)；活力指數以CK，50 μmol·L-1，100 μmol·L-1，200 μmol·L-1MT浸種24 h較好，顯著高于其他浸種時長處理(P<0.05)。

2.2 MT浸種處理下無芒雀麥種子萌發期抗旱效應

使用單一指標分析無芒雀麥的抗旱性具有片面性，采用隸屬函數計算可以克服少數指標評價的不足，因其得到的值為0～1區間內的純數而使各項指標具有可比性，再結合權重對每個處理各指標的隸屬函數值求和，從而可對各處理進行綜合性評價。在表2中，D值代表外源MT浸種時長及浸種濃度配比下無芒雀麥種子萌發的抗旱效應，隸屬函數綜合分析結果顯示，PEG+MT75+T24處理的綜合得分值最高，即MT濃度為75 μmol·L-1浸種24 h時效果最好。各處理綜合得分大小順序如下：PEG+MT75+T24>PEG+MT0+T12>PEG+MT200+T24>PEG+MT100+T24>PEG+MT50+T24>PEG+MT75+T12>PEG+MT25+T12>PEG+MT50+T48>PEG+MT25+T24>PEG+MT0+T24>PEG+MT25+T48>PEG+MT200+T48>PEG+MT100+T48>PEG+MT50+T12>PEG+MT200+T12>PEG+MT75+T48>PEG+MT100+T12>PEG+MT0+T48。

表2 無芒雀麥不同萌發指標隸屬函數分析Table 2 Membership function analysis of different germination indexes of Bromus inermis

3 討論

干旱作為一個重要的環境逆境因子已經成為世界性災害之一，不僅直接影響到植物種子萌發，而且會造成植物產量和品質的下降[30]。MT是一種多功能的效性分子，不僅具有生長素的部分生物學活性，而且能夠調控逆境中植物種子的萌發[31-32]。研究表明，利用MT浸泡燕麥種子，發現100 μmol·L-1MT處理促進種子萌發，進而使幼苗的株高、莖粗及生物積累量有了大幅度提升[14]。梁佳等[12]研究發現，經MT(0.25和0.5 mmol·L-1)引發可有效促進干旱脅迫下種子萌發，MT濃度為0.5 mmol·L-1時效果最佳。本研究進一步證實了MT對非生物脅迫的效應，干旱脅迫下無芒雀麥種子的發芽率隨MT濃度的增加呈先升高后下降的趨勢，MT濃度為50 μmol·L-1時，種子萌發率達最大值。本試驗結果表明，MT對無芒雀麥種子萌發的影響與所施用的劑量密切相關，適宜濃度MT(50 μmol·L-1MT)可緩解干旱脅迫對無芒雀麥種子萌發產生的抑制作用。

發芽指數和活力指數是反映種子活力的重要指標，水和氧氣是種子發芽的決定性因素，種子吸水多少與浸種時間長短有密切關系，但并不代表浸種時間越長越有利于種子發芽，在最適的MT浸種濃度下，浸種時長對種子活力影響不一樣。發芽指數及活力指數最高的浸種時長是24 h，延長和縮短浸種時長會使種子發芽指數及活力指數下降。由此可見，無芒雀麥種子活力高低與MT浸種濃度和浸種時長密切相關，必須優化浸種濃度和時長才能達到最佳的種子發芽效果。

本研究發現，在同一濃度條件下，不同浸種時長處理對種子萌發的影響存在差異。無芒雀麥種子在高濃度下隨浸種時長的增加，所有指標表現出先增加后降低的趨勢，說明MT對種子萌發存在一定的濃度效應。此外，在同一浸種時長下，不同濃度MT處理后，種子萌發的單項指標也存在較大差異，這與干旱脅迫條件下MT浸種處理玉米(Zeamays)種子的研究結果相似，均表現出MT對種子萌發的時間效應[33]。綜合來看，MT浸種濃度、浸種時長及兩者間的交互作用對無芒雀麥種子萌發均有不同的效應，至于這些因素是如何作用于種子內部而引起其生理生化的變化，還有待進一步研究。

4 結論

本研究結果表明，各濃度外源MT浸種不同時長均可有效緩解干旱脅迫對無芒雀麥種子萌發的抑制作用，適宜的MT浸種濃度及浸種時長可提高無芒雀麥種子在萌發期的抗旱效應。利用隸屬函數建立的綜合評價體系表明，無芒雀麥種子采用75 μmol·L-1MT浸種24 h后的萌發期抗旱效果最佳，有助于提高無芒雀麥在萌發期的抗旱能力及幼苗群體形態建成，研究結果為外源MT應用于干旱半干旱區草地建植和生態修復的草種引發提供了參考依據。