基于表型性狀的羊草遺傳多樣性評價

侯向陽， 白烏云

(1.山西農業大學草業學院， 山西 晉中 030801； 2.內蒙古師范大學化學與環境科學學院/內蒙古自治區環境化學重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010022； 3.中國農業科學院草原研究所， 內蒙古 呼和浩特010010)

羊草(Leymuschinensis)是禾本科賴草屬多年生根莖型牧草，是歐亞草原東部半干旱草原優勢種之一，是草甸草原的主要建群種和優勢種，典型草原和鹽生草甸的優勢種，荒漠草原的恒有種，也是建植人工草地和治理鹽堿化草地的理想草種[1]。羊草在不同生境中廣泛分布，生境生態地理條件復雜多樣，生態適應性強，具有高遺傳多樣性的環境基礎；但以無性繁殖為主的繁殖格局可能限制羊草遺傳多樣性。申俊芳等[2]認為，羊草不同基因型間具有類似于物種間的生態位互補效應，能提高羊草種群對干擾的抗性?？紫檐姷萚3]認為，較高的遺傳多樣性是羊草抗寒、耐旱、耐鹽堿等多重抗逆性的遺傳基礎。種內遺傳多樣性是物種以上水平多樣性的重要基礎，也決定物種進化潛力和抵御干擾的能力。氣候暖干化、過度放牧、土壤鹽堿化和生境破碎化嚴重影響我國北方羊草草原區，羊草遺傳多樣性面臨嚴重威脅[4]。

研究遺傳多樣性不僅可以揭示物種或居群的進化歷史及未來進化方向，而且在保護遺傳基因資源、生物資源開發與可持續利用乃至世界糧食安全方面均具有重要意義。羊草適口性好、耐牧，是重要的飼用草和生態草[5]。國內學者主要關注羊草種質資源收集和抗逆性能評價[6-7]、生產性能及栽培技術研究[8-9]，但基于性狀的遺傳多樣性評價研究，特別是根莖克隆繁殖性狀的遺傳多樣性研究仍顯不足?；谛誀畹倪z傳多樣性評價對于合理利用羊草種質資源、綜合評價親本、推動牧草育種及種質創新均具有重要意義，也是探索羊草大尺度長期適應機制研究的基礎工作。

本文以不同地理來源66份羊草為試驗材料，在同質園栽培條件下，研究羊草質量性狀和數量性狀的遺傳多樣性，并繪制了羊草遺傳多樣性地理分布圖，以期為羊草遺傳多樣性保護和羊草種質資源合理開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗地概況

本試驗從中國農業科學院草原研究所羊草種質資源圃中選取不同地理來源66份羊草作為試驗材料，采樣地理范圍為35°31′～49°47′ N，102°45′～124°31′ E(圖1)，海拔9～2 000 m。羊草采樣點年平均氣溫-2.1～13.3℃，年平均降水量166.6～695.6 mm。不同采樣點之間的平均距離為621.02 km，最短距離為29.80 km，最遠為1 967.58 km[10]。

本試驗在中國農業科學院草原研究所農牧交錯區試驗示范基地進行(圖1)。試驗基地位于呼和浩特市土默特左旗沙爾沁鄉(40°34′～40°35′ N，111°45′～111°47′ E，海拔1 055 m)，地處大青山與和林格爾丘陵之間的廣闊平原地區，屬于半干旱大陸性氣候，年平均降水量為400 mm左右，年平均氣溫為5.6℃，≥10℃的積溫為2 700℃以上[10]。試驗地土壤為淡栗鈣土和草甸土，中沙土壤，試驗地0～60 cm土層平均指標為：pH8.46，電導率0.101 mS·cm-1，全氮含量1.059%，全鉀含量1.85%，銨態氮含量4.138 mg·kg-1，硝態氮含量1.97 mg·kg-1，速效鉀含量82.16 mg·kg-1(國家土壤質量呼和浩特觀測實驗站提供)[11]。

圖1 羊草采樣點分布圖Fig.1 Diagram of sampling sites distribution of L. chinensis

1.2 試驗設計與試驗方法

土壤條件均勻、平坦的長方形試驗地，經秋、春兩次機械和人工處理后，分隔成若干個5 m×5 m的生長小區。為消除邊緣效應，試驗地四邊各留5 m空地。2018年4月21日待羊草返青展葉后，用直徑為7.5 cm的不銹鋼移苗器挖取羊草，每個羊草3個重復，挖取深度為25 cm，挑選長勢接近的均有4～5片葉子、須根完整、帶一節短根莖、無抽穗跡象的母株[10]，按完全隨機設計帶土移栽至各小區中心位置，覆土壓實，立即澆水，之后每周澆1次水，共澆水4次，確保成活。成活后，不施肥、不灌溉，適時鋤雜草，統一管理[10]。

移栽一周后，記錄成活母株數，記錄第一個根莖子株出土日期，抽穗期記錄抽穗母株數，計算母株抽穗率(Heading rate，HR)[12]。2018年8月初，記錄葉長(Leaf length，LL)、葉寬(Leaf width，LW)、株高(Plant height，PH)和莖長(Stem length，SL)[13]，并計算葉片大小(LW×LL)和葉長寬比(LL/LW)。2018年9月末，記錄母株叢中的分蘗子株數和從母株叢向外擴展的根莖子株數(Number of extravaginal ramets，NER)，并計算母株分蘗倍數(Multiple of genets through tillering，MT)、克隆生長率(Clonal growth rate，CGR)[14]和母株根莖擴展增加倍數(Multiple of genets through rhizome extension，MR)[10]。同時記錄根莖擴展方向數(Number of rhizome extension directions，NED)、各方向上的擴展距離、單向最大距離(Maximum one-direction extended distance，MED)，并計算累積擴展距離(Accumulated extended distance，AED)、擴展距離(Extended distance，ED)和擴展面積(Extended area，EA)[1,10]。2018年8月初，無干旱脅迫、日照不強烈天氣條件下，記錄羊草葉色、葉片軟硬(相對觸感)、葉片卷曲、葉片生長習性和銹病情況等質量性狀[15]。移栽一年時(2019年4月末)，羊草返青展葉后再次記錄根莖子株數，計算根莖株跨年增加倍數(Multiple of NER after a dormancy period，MRD)[10]。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 質量性狀的遺傳多樣性

羊草5個質量性狀的遺傳多樣性指數平均為0.861，由大至小依次為:銹病發生程度(1.341)>葉片軟硬(1.078)>葉片卷曲(1.021)>葉色(0.494)>葉片生長習性(0.369)。試驗羊草中灰綠型羊草占絕大多數(占86.3%)，葉片的生長習性多為斜上舉型(占87.9%)，但在銹病發生程度、葉片軟硬和葉片卷曲方面差異較大，遺傳多樣性相對較高(表1)。

表1 羊草種質質量性狀的遺傳多樣性(H′)Table 1 Genetic diversity (H′) of qualitative traits of L. chinensis germplasms

2.2 數量性狀的遺傳多樣性

供試66份羊草種質17個數量性狀的遺傳多樣性分析結果見表2。葉長寬比(LL/LW)的遺傳多樣性最高，為1.518；根莖單向最大擴展距離(MRD)的遺傳多樣性最低，為0.632。遺傳多樣性指數由大至小依次為：LL/LW>ED>HR>PH>LW×LL>SL>LL>MED>LW>AED>MT>EA>CGR>NER>MR>MRD。17個數量性狀的多樣性指數平均值為1.257，13個性狀的多樣性指數大于平均值，說明所研究的多數性狀具有豐富的遺傳多樣性，羊草遺傳基礎廣、差異大。

表2 羊草種質數量性狀的遺傳多樣性(H′)Table 2 Genetic diversity (H′) of quantitative traits of L. chinensis germplasms

2.3 羊草遺傳多樣性的地理分布

羊草遺傳多樣性的地理分布(表3和圖2)顯示，內蒙古中部地區46°～42°N，114°～118°E范圍內羊草遺傳多樣性最高，其次為50°～46°N，102°～106°E，而50°～46°N，122°～126°E范圍內羊草遺傳多樣性相對最低。

表3 羊草種質遺傳多樣性(H)的地理分布Table 3 Geographical distribution of genetic diversity (H) of L. chinensis

圖2 羊草種質遺傳多樣性(H)的地理分布Fig.2 Geographical distribution of genetic diversity (H) of L. chinensis germplasms

3 討論

近30多年來，分子標記技術快速發展，已經被廣泛應用于羊草遺傳多樣性和系統發育研究中[18-19]。分子標記技術雖然在分析羊草遺傳多樣性方面有顯著優勢，但往往受種群或基因型數量限制，不能取代基于大量種質材料的形態學分析[20]。本文基于形態學分析進行了羊草遺傳多樣性評價，對于形態變異較大、遺傳變異較小的羊草[21]，先進行表型選擇，再進行分子標記與表型選擇相結合的遺傳多樣性評價是必要的。

本研究發現數量性狀的遺傳多樣性高于質量性狀，與徐夙俠[21]的研究結果相一致。植物遺傳多樣性受很多因素影響，如Yuan等[22]研究表明，野生羊草種群的遺傳多樣性高于移栽種群。本文研究發現即使在栽培條件下，羊草不同性狀具有較高的遺傳多樣性，由此可以推斷在野外條件下，羊草遺傳多樣性可能更高。本文發現，羊草數量性狀中株高、葉片大小、擴展距離、葉長、分蘗株數等性狀的遺傳多樣性相對較高，這與Liu等[15]研究結果相一致。一般認為，無性繁殖力強的植物其種群多為遺傳單態[23]，然而日漸增多的研究表明，克隆植物種群中存在大量遺傳多樣性[24-25]，表明我們對克隆植物遺傳多樣性格局的認識仍很不充分，應加強關鍵植物種遺傳多樣性及其成因研究。

羊草遺傳多樣性地理分布分析發現，羊草遺傳多樣高的區域海拔相對較高、年均溫相對較低、年均降水量相對較少，更重要的是平均溫度和平均降水量的變化范圍相對較大，可見，水熱條件導致的環境異質性可能對羊草遺傳多樣性具有一定影響。羊草遺傳多樣性最豐富的區域為錫林郭勒盟中西部地區，該區是我國四大牧區之一的內蒙古牧區的核心區域，長期以草地放牧畜牧業為主；羊草遺傳多樣性最低的區域為內蒙古扎蘭屯市與黑龍江省接壤的草地向森地的過渡帶和草地農田過渡帶，該區域土地利用變化大、城市化速度較快[26]。全球氣候變化、土地利用變化、過度放牧和土壤鹽漬化日益加重導致的草地退化使羊草遺傳多樣性降低[15]。在自然和人為雙重干擾下，羊草種質資源遺傳多樣性面臨嚴重威脅[27]，應重視羊草等草地植物優勢種遺傳多樣性的保護。

4 結論

本文以不同地理來源66份羊草為試驗材料，在同質園栽培條件下，基于17個表型和繁殖相關性狀，計算Shannon-Wiener多樣性指數，分析羊草遺傳多樣性地理分布，結果標明：羊草不同性狀的遺傳多樣性差異較大，數量性狀的遺傳多樣性高于質量性狀；5個質量性狀的遺傳多樣性指數平均為0.861，其中銹病發生程度遺傳多樣性最高；17個數量性狀的多樣性指數平均為1.257，其中葉長寬比遺傳多樣性最高；內蒙古中部地區46°～42° N,114°～118° E是羊草遺傳多樣性分布中心，也是羊草遺傳多樣性保護的重點區域。