殼聚糖基抑菌凝膠劑的制備及其性能

張 濤， 王富平， 陳國寶， 吳基玉， 龐亞妮， 陳忠敏

(1. 重慶理工大學 藥學與生物工程學院， 重慶 400054； 2. 重慶華倫醫療器械有限公司， 重慶 400039)

創傷是由多因素引起的真皮淺層及表皮層的損傷，創傷處常常會出現炎癥反應及細菌感染，導致難以愈合[1-2]。抗生素是目前應用最廣泛的抗菌藥物，但其穩定性較差，加上不規范使用造成大量耐藥菌出現[3]。無機抗菌劑如銀、鋅、銅、鈦等金屬氧化物及其離子具有廣譜抑菌性,但其潛在的毒性及生物安全性還有待進一步研究[4]。凝膠劑具有潤滑皮膚、保護創面的作用，且能夠增加藥物在皮膚局部累積作用達到持續釋放，因此,從生物材料的角度制備一種在傷面處具有抑菌和促愈合的凝膠劑是非常有意義的。

凝膠劑一般要求常溫時保持膠狀，均勻細膩，凝膠基底與藥物無理化作用，在傷面處可通過釋放生物制劑促進上皮化[5]。針對皮膚表面的細菌感染和全層皮膚損傷修復，采用具有良好抑菌性能的天然聚合物制備凝膠劑是最優選擇，因為天然聚合物比合成聚合物具有更好的生物相容性和更低的免疫原性。絲素蛋白(SF)和 絲膠蛋白(SS)是從家蠶蠶繭中提取的天然大分子蛋白。有研究表明，SF具有良好的生物相容性，有抑菌和促愈合作用[6]；SS同樣具有諸多優異的生物活性，如抑菌、抗凝血以及促進細胞黏附和增殖等作用[7]。SS、SF都具有良好的抑菌性、促創口愈合性能、可降解性和低免疫原性，適于作為傷口敷料的原料。殼聚糖(CS)是一種天然多糖，具有良好的生物相容性和抑菌性，能夠生物降解且產物無毒害，可以促進傷口修復和組織再生，是良好的生物醫用材料[8]。甘油磷酸鈉(GP)為弱堿性化合物(pH值為6.34)，無細胞毒性。殼聚糖-甘油磷酸鈉體系由于高含水量、溫敏特性和良好的生物相容性，已被廣泛應用到組織工程領域[9]，但該凝膠體系是通過物理交聯形成的，存在力學性能低、黏度小和抑菌效果較差等問題。

基于以上對殼聚糖-甘油磷酸鈉體系、SS和SF在醫用材料方面的研究，本文以殼聚糖為基底，通過添加羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)改性制備得到黏度適中便于涂抹的凝膠劑基質，再分別加入SF、SS以提高凝膠劑基質的抑菌性能，篩選出一種具有良好生物相容性、抑菌性的復合凝膠劑。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

材料：中等級蠶繭，重慶纖維檢驗所；透析袋(長為0.4 m，寬為44 mm，截留分子質量為8～12 ku)，北京索萊寶生物技術有限公司；中性蛋白酶(活力為20萬U/g)，美國Sigma公司；殼聚糖(CS,脫乙酰度≥95%)、Triton X-100，生工生物股份有限公司；甘油磷酸鈉(GP)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，成都科龍化工試劑廠；牛肉膏、蛋白胨，北京奧博星生物科技有限公司；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，由重慶理工大學微生物實驗室提供；胰蛋白酶，美國Gibco公司；DMEM HIGH培養基、胎牛血清(FBS)，美國HyClone公司；氨芐青霉素(Ampicillin)、硫酸鏈霉素(Streptomycin sulfate)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、二甲基亞砜(PMSO)，北京Solarbio 生物科技有限公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、碘化丙啶(PI)，上海翔圣生物科技有限公司；實驗大鼠(SD品系)，重慶萊彼特生物科技有限公司；濃鹽酸、碳酸鈉、碳酸氫鈉、異丙醚等均為分析純，市售。

儀器：SW-CC-3F超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術有限公司)；FD-1-50真空冷凍干燥機(上海比郎儀器有限公司)；Varian 640型傅里葉紅外光譜儀(美國Varian公司)；SHA-C水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇中大儀器廠)；Heraeus CO2培養箱(賽默飛世爾科技有限公司)；PHS-3C型pH計(上海虹益儀器有限公司)；DDS-3C型臺式電導率儀(上海雷磁儀器有限公司)；HH-8型數顯式恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；Multiskan GO酶標儀(美國 Thermo公司)。

1.2 試樣的制備

1.2.1 SS和SF的制備

將繭殼用異丙醚浸泡2 d除蠟后，用無水乙醇浸泡2 d除去雜質，然后放入去離子水中沸煮約6 h脫膠，去除絲素蛋白(SF)纖維余下淡黃色液體，將淡黃色液體經過超濾膜過濾后，經冷凍干燥得到SS粉末[10]。

按照文獻[11]方法將蠶繭用異丙醚浸泡2 d除蠟后，用無水乙醇浸泡2 d除雜。將處理好的蠶繭放入去離子水中煮沸脫膠得到纖維狀絲素(SF)，將絲素纖維溶解在CaCl2/C2H5OH/H2O中，再裝入透析袋在蒸餾水中透析3 d取出，用中性蛋白酶酶解，然后用超濾膜過濾，真空冷凍干燥得到SF粉末。

1.2.2 復合凝膠劑的制備

將CS溶解在0.1 mol/L的HCl中，配成質量分數為3%的CS溶液；將GP溶解在0.1 mol/L的NaHCO3溶液中，配成質量分數為50%的GP溶液。在冰浴條件下，將4.5 mL的GP溶液緩慢加入至10 mL的CS溶液中并不斷攪拌，得到CS/GP體系。再向CS/GP體系中加入質量分數為1.5%的CMC-Na粉末，于37 ℃水浴鍋中水浴加熱3～4 min，制得外觀良好，均勻無顆粒感的凝膠劑基質。向凝膠劑基質中加入不同質量分數(5%、10%、15%)的SS或SF，攪拌均勻后即可得到復合凝膠劑。

1.3 測試與表征

1.3.1 抑菌性測試

參照文獻[12]方法采用浸提液法對復合凝膠劑進行抑菌性測試。將凝膠劑樣品用紫外光照射30 min后，取約1 mL凝膠劑加入9 mL無菌水，封存在15 mL的離心管中。離心管置于恒溫振蕩器(37 ℃、100 r/min)放置3 d，隨后將離心管轉移至超凈工作臺，用針式濾膜過濾除雜、除菌，即可得到浸提液。用牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉、NaCl、去離子水配制普通溶菌肉湯培養基(LB培養基)。先將100 μL浸提液均勻涂布在平板上，待完全吸收后，再均勻涂布100 μL細菌懸液(濃度為1×109CFU/mL)。培養基倒置培養12 h。由對照組和實驗組的菌落數來確定復合凝膠劑的抑菌率，計算公式[13]為

式中：a0為涂抹含有絲素蛋白或絲膠蛋白的復合凝膠劑浸提液后平板的菌落數；a為涂抹凝膠劑基質浸提液后平板的菌落數。

1.3.2 化學結構表征

采用傅里葉變換紅外光譜儀(FI-IR)測試試樣的紅外光譜，測試范圍為4 500～400 cm-1,分辨率為4 cm-1。

1.3.3 抑菌機制分析

1.3.3.1細菌懸液吸光度(OD)測定 首先將大腸桿菌懸液(1×107CFU/mL)按每孔100 μL接種于96孔板上，分別加入不同質量分數(0%、25%、50%、75%、100%)的復合凝膠劑浸提液、陽性對照組(含0.1% Triton X-100、50 μg/mL的氨芐青霉素)各100 μL，質量分數為100%的凝膠劑浸提液加入到100 μL的無菌水中作為空白對照。再將96孔板放在生化培養箱中于37 ℃培養12 h，然后取出加入碘化丙啶(PI)使其終質量濃度為50 μg/mL。于37 ℃孵育30 min后在酶標儀上測定OD值，激發光波長為488 nm，每組測定6個平行樣品，取平均值，以加入Triton X-100組測得的OD值認定透過率為100%，計算其他組中的相對透過率。其計算公式為

式中：X為細胞膜相對透過率，%；OD1和OD2分別為其他各組和Triton X-100組的吸光度平均值。

1.3.3.2細菌電導率測試 用接種環取下具有代表性的菌落，置于適量的液體培養基中，在溫度為37 ℃，轉速為150 r/min條件下振蕩搖晃液體培養基至細菌濃度達1×107CFU/mL，分別向細菌懸液中加入10 mL含不同質量分數(5%、10%、15%)SS的凝膠劑浸提液作為材料實驗組。采用臺式電導率儀每隔2 h測量混勻后溶液的電導率，以菌液中加入不含SS的凝膠劑基質浸提液作為對照組，每組實驗重復3次，取平均值。

1.3.4 生物安全性測試

1.3.4.1復合凝膠劑的細胞毒性檢測 用MTT法檢測凝膠浸提液對L929細胞增殖活性的影響。將細胞在DMEM完全培養基(DMEMHIGH培養基、胎牛血清、雙抗體積比為9∶1∶0.2)中培養，當90%細胞貼壁后用胰蛋白酶(0.05%)去除貼壁，將處于對數增長期的細胞懸液(5×104個/mL)按每孔200 μL接種于96孔板，置于CO2培養箱中。待細胞完全貼壁后棄去原培養基，分別加入材料實驗組(含不同質量分數(0%、25%、50%、75%、100%)浸提液的DMEM完全培養基)、空白對照組(DMEM完全培養基)各200 μL繼續在相同條件培養，4 h后用移液槍移除96孔板內液體，加入150 μL的DMSO放入酶標儀中振蕩10 min，檢測在波長為490 nm處的OD值，每組平行測定6個樣品，取平均值。以細胞相對增長率(Gr)來評定復合凝膠劑的細胞毒性，其計算公式為

式中，OD和OD0分別為材料實驗組和空白對照組的吸光度平均值。參考文獻[14]以空白對照組細胞相對增長率Gr為標準對復合凝膠劑劃分安全等級。

1.3.4.2復合凝膠劑的皮膚刺激性測試 選取成年健康雌性SD大鼠9只(體重為220 g，飼養溫度為(23±3) ℃，每日光照12 h，自由飲食)，3只1組隨機分為3組，實驗前以大鼠脊柱為中線，剪去背部毛發制作一個1.5 cm×1.5 cm的皮膚暴露面，作為實驗和觀察部位。用吸收2 mL甲醛溶液(質量分數為10%)的醫用紗布作為陽性對照，均勻涂抹2 cm3復合凝膠劑的醫用紗布作為實驗組，將紗布包裹在大鼠的實驗部位，在接觸0、(8±0.5)、(24±2)、(48±2) h后，取下紗布作觀察記錄。

2 結果與討論

2.1 凝膠劑的抑菌性能分析

圖1示出加入含SS或SF的復合凝膠劑浸提液涂布平板后形成的菌落分布。可以看出，隨著SS或SF在凝膠劑中質量分數的增加，平板上菌落數越少。但是實驗過程中發現，隨著SS或SF質量分數的增加，復合凝膠劑的黏度降低甚至無法交聯，這可能是因為SS和SF表面存在的許多可以交聯和修飾的活性基團，在溫度為37 ℃ 時與CS部分基團相結合，影響到CS鏈間片段的物理結合，導致凝膠劑黏度下降[15-17]，因此，本文實驗沒有進一步在凝膠劑基底中添加更高質量分數的SS或SF。

與未添加SS和SF的凝膠劑基質浸提液相比，加入SS、SF后凝膠劑的浸提液都表現出了更好的抑菌效果，抑菌統計結果如圖2所示。通過計算平板上的菌落數來評估凝膠劑的抑菌性能發現，隨著SS和SF質量分數的增加，復合凝膠劑的抑菌性能提高。但相比之下，加入SS復合凝膠劑的抑菌效果更加優異，當SS質量分數為15%時對金黃色葡萄球菌(革蘭氏陽性菌)的抑菌率達到(86.30±2.51)%，對大腸桿菌(革蘭氏陰性菌)的抑菌率為(96.20±3.40)%。

圖1 不同質量分數的SS和SF復合凝膠劑浸提液抑菌效果Fig.1 Antibacterial effects of different mass fractions of SS (a) and SF (b) composite gel extracts

圖2 不同質量分數的SS和SF 復合凝膠劑浸提液抑菌性Fig.2 Antibacterial properties of different mass fractions of SS (a) and SF (b) composite gel extracts

2.2 凝膠劑的二級結構分析

本文采用紅外光譜法來分析凝膠劑中各單一組分與SS復合凝膠劑(SS質量分數為15%)在二級構象上的差異性。圖3示出本文實驗所用的原材料及復合凝膠劑的紅外光譜。可以看出，CS在1 667 cm-1處的特征峰歸屬于酰胺Ⅰ，而在1 056和985 cm-1處的特征峰歸因于C—O拉伸的骨骼振動。SS具有的β-折疊結構對應于1 653 cm-1(酰胺Ⅰ)、1 542 cm-1(酰胺Ⅱ)和1 230 cm-1(酰胺Ⅲ)處的特征峰。復合凝膠劑紅外光譜中酰胺Ⅰ的特征峰偏移至1 624 cm-1處且強度降低，表明有大量強氫鍵形成。此外，CS(3 345 cm-1)、SS(3 304 cm-1)、GP(3 218 cm-1)、CMC-Na(3 302 cm-1)中均出現—OH的伸縮振動特征峰，而在復合凝膠劑中未出現新峰，但該特征峰向左偏移至3 355 cm-1處。

圖3 復合凝膠劑及其各組分的紅外光譜Fig.3 Infrared spectra of composite gel and its component

2.3 凝膠劑的抑菌機制分析

CS和SS的抑菌機制都是改變了細菌外膜的通透性，導致細菌外膜的電導率和完整性改變[18]。為研究復合凝膠劑的抑菌機制特別是對細菌細胞結構的影響，選取革蘭氏陰性菌大腸桿菌，測定加入不同質量分數的復合凝膠劑浸提液后細菌懸液的OD值，結果如表1所示。對多組數據間比較采用單因素方差分析(P<0.05認為差異具有統計學意義)發現經浸提液處理后的大腸桿菌懸液OD值明顯升高，且隨著浸提液質量分數的升高，OD值呈梯度上升(以Triton X-100為陽性組作為參考)，OD值的上升顯示了大腸桿菌胞內成分的大量釋放，說明細菌細胞膜的通透性增加，復合凝膠劑破壞了細菌細胞膜的完整性，從而發揮抑菌效果。

表1 不同質量分數浸提液對細菌細胞膜完整性的影響Tab.1 Effect of different mass fraction extracts on integrity of bacterial cell membrane

為進一步驗證復合凝膠劑的抑菌機制是其破壞了細菌細胞膜的完整性，測定了復合凝膠劑浸提液處理大腸桿菌8 h內電導率的變化，結果如圖4所示。

圖4 凝膠劑浸提液處理大腸桿菌8 h內電導率的變化Fig.4 Change of electrical conductivity of gel in 8 h after treatment of Escherichia coli

從圖4可以看出，在0～8 h內，實驗組和對照組的細菌懸液電導率都增加，這是由于細菌在生長過程中通過代謝作用將不帶電或帶弱電物質(碳水化合物、蛋白質等)轉化為電活性物質，因此，隨著細菌的生長,培養液的電導率上升。在實驗最初的2 h內含不同質量分數SS的復合凝膠劑浸提液處理后的菌液電導率增加最為顯著,而后增速減慢。由此可見，凝膠劑的抑菌作用主要發生在最初的2 h內。隨著SS質量分數的提高，對應時間內電導率降低，表明SS能夠阻礙細菌代謝過程中的離子交換，細菌懸液電導率的降低可能是由于含有絲氨酸、天冬氨酸、甘氨酸的SS通過靜電相互作用與大腸桿菌細胞膜發生誘導效應。SS的加入使帶電離子減少，細菌膜的滲透性下降，細菌細胞膜的完整性被破壞[19]，由此確認了復合凝膠劑破壞細菌細胞膜完整性的抑菌作用機制。

2.4 凝膠劑的生物安全性分析

2.4.1 凝膠劑的細胞毒性

作為潛在的外用創傷凝膠劑，應具有促進細胞增殖和細胞分化的作用。圖5示出采用MTT法檢測不同質量分數的復合凝膠劑浸提液對L929細胞增殖的影響結果。可以看出，細胞在含有不同質量分數SS復合凝膠劑浸提液的培養基中相對增長率均大于100%。根據GB/T 16886.5—2017《醫療器械生物學評價 第5部分:體外細胞毒性試驗》，經實驗材料處理后，細胞的相對增長率大于75%即可被認為無細胞毒性[20]，因此，本文制備的凝膠劑無細胞毒性。在加入浸提液24 h后各實驗組細胞生長情況均比空白組要好，且隨著浸提液中SS質量分數的增加，OD值也在相應增大。說明該凝膠劑具有良好的生物相容性并且能夠促進細胞增殖，滿足外用創傷的基本要求，可作進一步的應用研究。

圖5 L929細胞在含不同質量分數的 浸提液培養基中的生長情況Fig.5 Growth of L929 cells in extract medium containing different mass concentration

2.4.2 凝膠劑的皮膚刺激性

圖6示出復合凝膠劑對大鼠皮膚刺激性結果。可以看出：涂抹甲醛部位皮膚在8 h時出現紅腫，隨著時間延長皮膚腫塊增大，24 h時皮膚出現紅斑且隨時間增加紅斑越明顯；而涂抹凝膠劑部位皮膚一直未出現紅腫和紅斑，并且隨著時間延長，涂抹處皮膚更加紅潤光滑。這可能是因為SS降解為各種氨基酸被機體吸收，為表皮細胞提供營養物質而促進表皮修復[21]。

圖6 大鼠皮膚刺激反應圖Fig.6 Rat skin irritation response chart.(a) Skin reaction after applying formaldehyde; (b) Skin reaction after applying gel

3 結 論

本文以殼聚糖(CS)為基材通過改性制備了殼聚糖基抑菌凝膠劑，并探討了凝膠劑的抑菌性、二級構象、抑菌機制及生物相容性。研究結果表明：在以CS為凝膠劑基質中加入絲膠蛋白(SS)比加入絲素蛋白(SF)表現出更加優異的抑菌性，當絲膠蛋白質量分數為15%時對金黃色葡萄球菌的抑菌率為(86.30±2.51)%，對大腸桿菌的抑菌率為(96.20±3.40)%；所制備的復合凝膠劑的二級構象中有大量強氫鍵形成，表明其黏度和穩定性增強；復合凝膠劑通過改變細菌細胞膜的完整性從而發揮抑菌作用；復合凝膠劑無細胞毒性，無皮膚刺激性。本文實驗制備的復合凝膠劑性能較優，在生物材料領域具有潛在的應用價值。