新型稠雜環類尿酸轉運蛋白1抑制劑的合成及活性評價

謝福佳，王 偉，鐘 健，周志慧，方志杰

(1.南京理工大學，江蘇 南京 210094；2.江蘇正大清江制藥有限公司，江蘇 淮安 223001)

尿酸轉運蛋白1(URAT1)抑制劑可以抑制尿酸的重吸收、促進尿酸排泄[1-4]。已上市的URAT1抑制劑,如苯溴馬隆[5-6]、雷西納德(Lesinurad)[7]具有比較嚴重的副作用,研究人員開發了新一代的URAT1抑制劑Verinurad。

通過分析URAT1抑制劑相關的研究文獻[8-13]，對比Lesinuard和Verinurad結構(圖1)，發現2個化合物均存在硫代乙酸和芳香雜稠環結構，這2部分共同構成了藥物的藥效基團。作者以Verinurad為母核結構，對其進行結構修飾，設計了5個化合物(圖2)，通過2-甲基-2-(((6-三氟甲基)喹啉-4-基)硫代)丙酸乙酯(Ⅰ)和2-((3-(4-氯苯基)哌啶-4-基)硫代)-2-甲基丙酸乙酯(Ⅱ)(化合物Ⅰ和Ⅱ合成方法參考文獻[14-15])與醇胺進行酰化反應獲得，考察延長硫代支鏈、改變雜環結構對化合物體外抑制活性的影響。目標化合物的合成路線見圖3。

圖1 Lesinurad 和Verinurad的結構式Fig.1 Structural formulas of Lesinurad and Verinurad

圖2 經Verinurad結構修飾的目標化合物的結構式Fig.2 Structural formulas of target compourd by modification of Verinurad

圖3 目標化合物的合成路線Fig.3 Synthetic route of target compound

1 實驗

1.1 試劑與儀器

2-甲基-2-(((6-三氟甲基)喹啉-4-基)硫代)丙酸乙酯(Ⅰ，純度>97%)、2-((3-(4-氯苯基)哌啶-4-基)硫代)-2-甲基丙酸乙酯(Ⅱ，純度>97%)，江蘇正大清江制藥有限公司；胎牛血清(批號10099141)、DMEM培養基(批號10564)、胰蛋白酶(批號25200056)、G418(批號ant-gn-5)、磷酸緩沖液(批號14190250)、青霉素-鏈霉素(批號15070-063)，Invitrogen；14C-尿酸(批號ARC0513-250UCI)，ARC；二甲基亞砜(DMSO，批號D2650)，Sigma；苯溴馬隆(Cat.No.3562-84-3)，百靈威科技；葡萄糖酸鈉(Cat.No.527-07-1)、葡萄糖酸鉀(Cat.No.299-27-4)、葡萄糖酸鈣(Cat.No.299-28-5)，阿拉丁；其余所用試劑均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

C-MAG HS7型數顯磁力加熱攪拌器，IKA；Agilent 1200LC/6110MS型液相色譜-質譜儀，安捷倫科技有限公司；Bruker AVANCE Ⅲ 500MHz UltraShield-PlusTM型全數字化核磁共振波譜儀，瑞士Bruker公司；MicroBeta2微孔板計數器，PerkinElmer公司。

1.2 化合物的合成

1.2.1 化合物TF-001的合成

將化合物Ⅰ(0.5 g，1.46 mmol)、2 mL乙醇胺加入到50 mL三口瓶中，再加入0.1 mL 1，8-二氮雜環[5，4，0]十一烯-7(DBU)作為催化劑，升溫至75～85 ℃加熱反應4～5 h，粗品進行柱層析(二氯甲烷和甲醇洗脫)，得到黃色固體120 mg，收率23.0%。

1.2.2 化合物TF-002的合成

將化合物Ⅰ(0.5 g，1.46 mmol)、2 mL丙醇胺加入到50 mL三口瓶中，再加入0.1 mL DBU作為催化劑，升溫至75～85 ℃加熱反應4～5 h，粗品進行柱層析(二氯甲烷和甲醇洗脫)，得到黃色油狀液體140 mg，收率26.0%。

1.2.3 化合物TF-003的合成

將化合物Ⅰ(0.5 g，1.46 mmol)、2 mL二乙醇胺加入到50 mL三口瓶中，再加入0.1 mL DBU作為催化劑，升溫至75～85 ℃加熱反應4～5 h，粗品進行柱層析(二氯甲烷和甲醇洗脫)，得到白色油狀液體121 mg，收率20.6%。

1.2.4 化合物TF-004的合成

將化合物Ⅱ(0.5 g，1.49 mmol)、2 mL乙醇胺加入到50 mL三口瓶中，再加入0.1 g叔丁醇鉀作為催化劑，升溫至75～85 ℃加熱反應4～5 h，粗品進行柱層析(二氯甲烷和甲醇洗脫)，得到淡黃色固體160 mg，收率30.4%。

1.2.5 化合物TF-005的合成

將化合物Ⅱ(0.5 g，1.49 mmol)、2 mL丙醇胺加入到50 mL三口瓶中，再加入0.1 g叔丁醇鉀作為催化劑，升溫至75～85 ℃加熱反應4～5 h，粗品進行柱層析(二氯甲烷和甲醇洗脫)，得到淡黃色固體120 mg，收率21.8%。

1.3 化合物的活性評價

1.3.1 溶液的配制和培養基

分別配制Cl-free HBSS緩沖液、裂解液、125 mmol·L-1葡萄糖酸鈉、4.8 mmol·L-1葡萄糖酸鉀、1.3 mmol·L-1葡萄糖酸鈣、1.2 mmol·L-1KH2PO4、1.2 mmol·L-1MgSO4、5.6 mmol·L-1葡萄糖、25 mmol·L-1HEPES(pH值7.4)、100 mmol·L-1NaOH。

培養基組成：DMEM培養基+10%胎牛血清+500 μg·mL-1G418+1%P/S。

1.3.2 細胞培養及接種

培養穩定表達hURAT1的HEK-293T細胞株，待細胞長到80%滿時，棄掉培養基，加PBS緩沖液清洗細胞1次；之后加入胰酶-EDTA進行消化，待細胞脫壁時加入培養基，吹打使細胞脫落，離心收集細胞，加入培養基吹打成細胞懸液。

調整細胞密度為7×105個·mL-1，按每孔100 μL接種到96孔板中，培養12～24 h。

1.3.3 化合物溶液的配制

用DMSO將化合物配制成20 mmol·L-1的母液，再用DMSO稀釋成1 mmol·L-1的溶液加入96孔板中。在96孔板上，另分別設置質控化合物，作為100×化合物板；在另一塊96孔板上用Cl-free HBSS緩沖液進行對應孔的50倍稀釋，作為2×化合物板；之后在一塊新的96孔板上每孔加入30 μL含0.1 μCi·mL-114C-尿酸的緩沖液和30 μL的2×化合物，作為1×化合物板，待用。

1.3.414C-尿酸在穩定表達hURAT1細胞中的吸收

待96孔板中細胞培養貼壁后即可進行吸收實驗。每孔用200 μL預熱的緩沖液洗滌細胞1次，吸干各孔；之后立即加入50 μL含有對應化合物和0.1 μCi·mL-114C-尿酸溶液。將96孔板在37 ℃培養箱中孵育5 min,每孔立即加入150 μL冰冷的緩沖液以終止吸收。用緩沖液清洗每孔3次，清洗過程中，盡量避免細胞脫落。每孔加入50 μL裂解液，置于振蕩器上以900 r·min-1的速度振蕩5 min；每孔再加入150 μL閃爍液Microsint40，以900 r·min-1的速度振蕩5 min。最后，微孔板送至MicroBeta2微孔板計數器測定放射活性。分析數據，用GraphPad Prism 5 軟件計算各化合物的IC50值。

2 結果與討論

2.1 化合物的表征

化合物TF-001：m.p.153.2～157.8 ℃;MS,m/z：359.1[M+H]+；1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ:8.81～8.82(dd,J=3.0 Hz、5.0 Hz,1H),8.54(s,1H),8.18～8.20(d,J=8.5 Hz,1H),7.89～7.91(t,J=2.0 Hz,1H),7.35～7.34 (d,J=4.5 Hz,1H),7.19(br,1H),3.67～3.69(t,J=4.5 Hz、5.0 Hz,2H),3.43～3.46(dd,J=5.5 Hz、10.5 Hz,2H),1.75(s,6H)。

化合物TF-002：MS,m/z：373.2[M+H]+；1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ:8.82～8.83(d,J=5.5 Hz,1H),8.54(s,1H),8.19～8.21(d,J=9.0 Hz,1H),7.90～7.92(dd,J=2.0 Hz、8.5 Hz,1H),7.31～7.32(d,J=4.0 Hz,1H),7.26(s,1H)，3.58～3.60(t,J=5.5 Hz,2H),3.41～3.44(dd,J=6.0 Hz、12.0 Hz,2H),1.75～1.63(m,8H)。

化合物TF-003：1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ:8.76～8.77(d,J=5.0 Hz,1H),8.61(s,1H),8.12～8.14(d,J=8.5 Hz,1H),7.84～7.85(t,J=2.0 Hz、7.0 Hz,1H),7.65～7.66(d,J=5.0 Hz,2H),3.72～3.74(t,J=5.0 Hz,4H),2.90～2.92(t,J=5.0 Hz,4H),1.67(s,6H)。

化合物TF-004：m.p.124.5～126.7 ℃；MS,m/z:351.1[M+H]+；1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ:8.39～8.40(d,J=5.5 Hz,1H),8.32(s,1H),7.44～7.45(dd,J=8.5 Hz,2H),7.30～7.32(dd,J=8.5 Hz,2H),7.14～7.27(m,2H),3.67～3.69(t,J=5.0 Hz,2H),3.42～3.45(dd,J=5.5 Hz、10.5 Hz,2H),1.61(s,6H)。

化合物TF-005：m.p.115.5～119.3 ℃；MS,m/z:365.0[M+H]+；1HNMR(400 MHz,CDCl3),δ:8.40～8.41(d,J=5.5 Hz,1H),8.33(s,1H),7.44～7.45(dd,J=8.0 Hz,2H),7.31～7.33(dd,J=8.5 Hz,2H),7.10～7.27(m,2H),3.59～3.61(t,J=5.5 Hz,2H),3.40～3.43(dd,J=6.0 Hz、12.0 Hz,2H),1.60～1.69(m,6H)。

2.2 抑制活性結果(表1)

表1 抑制活性結果Tab.1 Inhibitory activity results

由表1可知，化合物TF-003的體外抑制活性優于對照藥苯溴馬隆。

3 結論

以2-甲基-2-(((6-三氟甲基)喹啉-4-基)硫代)丙酸乙酯(Ⅰ)和2-((3-(4-氯苯基)哌啶-4-基)硫代)-2-甲基丙酸乙酯(Ⅱ)與醇胺反應合成了5個新型稠雜環類化合物尿酸轉運蛋白1(URAT1)抑制劑TF-001、TF-002、TF-003、TF-004、TF-005，其中化合物TF-003的體外抑制活性優于對照藥苯溴馬隆。