精液中冷凍保護(hù)劑加入比例對(duì)冷凍復(fù)蘇后精子活動(dòng)力的影響研究

李洪成

精子冷凍是生殖輔助技術(shù)中的一種,也是精子庫(kù)的重要工作內(nèi)容。在精子冷凍復(fù)蘇后,精子成活率直接關(guān)系冷凍精子用于輔助生殖的效果［1］。有研究表 明［2］,精子冷凍后的活動(dòng)力與諸多因素有關(guān),主要包括精子質(zhì)量、冷凍方法、冷凍保護(hù)劑的使用,其中冷凍保護(hù)劑使用情況在精子冷凍中發(fā)揮重要作用。目前常用的精子冷凍保護(hù)劑為蛋黃甘油復(fù)合型冷凍保護(hù)劑,在使用該過(guò)程中冷凍保護(hù)劑與精液的配比對(duì)精子冷凍保護(hù)效果有一定的影響［3］。為了探討冷凍保護(hù)劑與精液配比對(duì)精子冷凍復(fù)蘇后的活動(dòng)力影響,本文選擇1∶1、1∶3 配比冷凍的精子進(jìn)行觀察,分析復(fù)蘇后前向運(yùn)動(dòng)精子百分比及精子活力情況,現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集 選擇2019 年3 月～2020 年6 月遼寧省婦幼保健院人類(lèi)精子庫(kù)精子捐獻(xiàn)志愿者20 例,取得志愿者知情同意后進(jìn)行實(shí)驗(yàn),均禁欲7 d 后,手淫法留取精液4 ml 置于無(wú)菌取精杯中,在37℃水浴箱中液化處理。根據(jù)《世界衛(wèi)生組織人類(lèi)精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(第5 版)》的相關(guān)要求［4］,對(duì)精液進(jìn)行處理。所有留取精液液化時(shí)間均≤1 h,精子濃度≥50× 106/ml,精子活力≥50%。

1.2 方法

1.2.1 冷凍保護(hù)劑配置 采用蛋黃甘油復(fù)合型冷凍劑作為冷凍保護(hù)劑,制備過(guò)程如下：向37.4 ml 葡萄糖溶液(5%)中加入58.6 ml 的枸櫞酸鈉溶液(2.9%),在向混合溶液中加入56 ml 甘油,充分混勻后,采用微孔過(guò)濾器過(guò)濾,孔徑選擇0.45 μm。過(guò)濾后的溶液中加入 48 ml 的新鮮蛋黃,調(diào)節(jié)pH 值至6.8～7.2。然后加入 0.5 ml 慶大霉素(8 IU)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn),將完成配置的冷凍保護(hù)劑在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行分裝,每份10 ml,置于-80℃凍存,冷凍保護(hù)劑需3 個(gè)月內(nèi)使用。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 取20 例志愿者精液,按照1∶3 分為甲組(1 ml)、乙組(3 ml)。取制備的蛋黃甘油復(fù)合型冷凍保護(hù)劑,按照1∶1、1∶3 的保護(hù)劑/精漿配比,分別向甲組、乙組中各加入1 ml 冷凍保護(hù)劑,完成實(shí)驗(yàn)分組。

1.2.3 冷凍與復(fù)蘇方法 完成兩組樣本制備后轉(zhuǎn)入凍存管中,置于4℃冰箱平衡10 min,然后經(jīng)10 min 的液氮薰蒸,最后在液氮中凍存。待48 h 后,取出凍存精液,放在37℃的恒溫水浴箱中進(jìn)行精子冷凍后復(fù)蘇。

1.2.4 精子活動(dòng)力檢查 精子活動(dòng)力分別以精子前向運(yùn)動(dòng)百分比、活力檢測(cè)并評(píng)價(jià),按照《手冊(cè)》標(biāo)準(zhǔn)和 要求,采用北京偉力彩色計(jì)算機(jī)輔助精液分析系統(tǒng)進(jìn)行復(fù)蘇后精液的處理分析,測(cè)定冷凍前及復(fù)蘇后前向運(yùn)動(dòng)與精子活力。前向運(yùn)動(dòng)(PR)是精子主動(dòng)呈現(xiàn)的直線(xiàn)或大圓周運(yùn)動(dòng),非前向運(yùn)動(dòng)(NP)表示所有他非前向的精子運(yùn)動(dòng),比如小圓周泳動(dòng)及尾部擺動(dòng)等。精子活力即精子總的活動(dòng)率,以NP+PR 表示。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)比兩組冷凍前、冷凍復(fù)蘇后前向運(yùn)動(dòng)精子百分比及精子活力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組冷凍前、冷凍復(fù)蘇后前向運(yùn)動(dòng)精子百分比對(duì)比 冷凍前,兩組前向運(yùn)動(dòng)精子百分比對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；冷凍復(fù)蘇后,兩組前向運(yùn)動(dòng)精子百分比均較冷凍前明顯下降,但乙組高于甲組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

表1 兩組冷凍前、冷凍復(fù)蘇后前向運(yùn)動(dòng)精子百分比對(duì)比(,%)

表1 兩組冷凍前、冷凍復(fù)蘇后前向運(yùn)動(dòng)精子百分比對(duì)比(,%)

注：與本組冷凍前對(duì)比,aP＜0.05；與甲組冷凍復(fù)蘇后對(duì)比,bP＜0.05

2.2 兩組冷凍前、冷凍復(fù)蘇后精子活力對(duì)比 冷凍前,兩組精子活力對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；冷凍復(fù)蘇后,兩組精子活力均較本組冷凍前明顯下降,但乙組高于甲組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組冷凍前、冷凍復(fù)蘇后精子活力對(duì)比(,%)

表2 兩組冷凍前、冷凍復(fù)蘇后精子活力對(duì)比(,%)

注：與本組冷凍前對(duì)比,aP＜0.05；與甲組冷凍復(fù)蘇后對(duì)比,bP＜0.05

3 討論

精子庫(kù)冷凍精子是用于人類(lèi)輔助生殖的重要技術(shù),精子冷凍后復(fù)蘇成活率直接關(guān)系著輔助生殖的效果［5］。在冷凍處理過(guò)程中,細(xì)胞外液會(huì)形成冰晶,使細(xì)胞外水分逐漸減少,增加了細(xì)胞外液的濃度,形成滲透壓差,從而使細(xì)胞內(nèi)水分流向細(xì)胞外,細(xì)胞脫水皺縮,從而形成凍存效果［6］。但精子冷凍過(guò)程還會(huì)產(chǎn)生活性氧,對(duì)精子細(xì)胞膜產(chǎn)生一定的破壞作用,使細(xì)胞內(nèi)也產(chǎn)生冰晶,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)外滲透壓差不明顯,影響凍存效果。而細(xì)胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生,還會(huì)影響精子的運(yùn)動(dòng)能力,且對(duì)精子的脫氧核糖核酸、線(xiàn)粒體功能等也會(huì)帶來(lái)?yè)p傷,致使精子活動(dòng)力降低,甚至導(dǎo)致精子死亡［7］。同時(shí),正常的精漿中含有抗氧化物質(zhì),能夠清除活性氧。凍存時(shí),細(xì)胞表面的超氧化物自由基、羥基會(huì)明顯增多,對(duì)精子保存不利。精子質(zhì)膜脂質(zhì)的過(guò)氧化在凍存時(shí)加劇,導(dǎo)致復(fù)蘇后精子功能受損,精子活動(dòng)力下降［8］。研究表明［9］,在精子凍融過(guò)程中,精子的頭部漿膜會(huì)發(fā)生破損、腫脹情況,增加精子膜結(jié)構(gòu)的不完整率,頂體膜及內(nèi)容物脫落、丟失,精子活性降低。通過(guò)提升精子的能量代謝,有助于使精子復(fù)蘇率和精子活力提升,保證精子細(xì)胞膜的完整性和通透性,防止凍存帶來(lái)的損傷。

基于此,很多學(xué)者一直在尋找冷凍保護(hù)的有效措施,目前除了選擇恰當(dāng)?shù)睦鋬龇椒?冷凍過(guò)程使用冷凍保護(hù)劑顯得尤為重要。冷凍保護(hù)劑的使用,使冷凍保護(hù)劑能夠通過(guò)融入精液中形成保護(hù)環(huán)境,減少冷凍造成的氧化損傷。并且,保護(hù)劑的加入能夠降低細(xì)胞外液的電解質(zhì)濃度,還有助于減輕對(duì)精子細(xì)胞產(chǎn)生的不利影響。所以,需要在精液凍存時(shí)加入冷凍保護(hù)劑,形成對(duì)精子細(xì)胞的保護(hù)。但實(shí)際上冷凍保護(hù)劑的加入比例會(huì)影響凍存保護(hù)效果,不同的保護(hù)劑/精漿配比產(chǎn)生的保護(hù)效果不同,并不是冷凍保護(hù)劑使用的越多越好［10］。精漿本身對(duì)精子的保護(hù)效果就很好,如果過(guò)多的加入冷凍保護(hù)劑,可能會(huì)破壞精漿的保護(hù)作用,起到反效果。因此,恰當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)劑/精漿配比在精液凍存中具有重要價(jià)值,對(duì)提升冷凍復(fù)蘇后精子活動(dòng)力具有一定的作用。目前常采用的保護(hù)劑/精漿配比為1∶1,但經(jīng)過(guò)實(shí)際工作經(jīng)驗(yàn)總結(jié)發(fā)現(xiàn),不同配比會(huì)影響精子復(fù)蘇后的活動(dòng)力,并且冷凍保護(hù)劑的制備和消耗會(huì)增加精子凍存成本。基于此,結(jié)合經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為1∶3 的保護(hù)劑/ 精漿配比也許不僅能夠達(dá)到理想的凍存保護(hù)作用,還能夠降低凍存保護(hù)劑使用量,節(jié)約成本。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證1∶1、1∶3 保護(hù)劑/精漿配比冷凍保護(hù)劑使用對(duì)冷凍復(fù)蘇后精子活動(dòng)力的影響,本次研究通過(guò)取志愿者精液進(jìn)行處理,按照保護(hù)劑/精漿配比1∶1 和1∶3 分為甲組和乙組,并進(jìn)行凍存-復(fù)蘇實(shí)驗(yàn),利用實(shí)驗(yàn)前后兩組的精子活動(dòng)力變化分析精液中加入冷凍保護(hù)劑比例帶來(lái)的影響。研究結(jié)果顯示,冷凍復(fù)蘇后,兩組前向運(yùn)動(dòng)精子百分比均較冷凍前明顯下降,但乙組前向運(yùn)動(dòng)精子百分比(42.36±4.63)%高于甲組的(33.48±4.56)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。冷凍復(fù)蘇后,兩組精子活力均較本組冷凍前明顯下降,但乙組精子活力(55.64±3.12)%高于甲組的(52.14±3.08)%,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。證實(shí)冷凍保存雖然能夠減緩精子失效速度,但仍然會(huì)降低冷凍復(fù)蘇后精子活動(dòng)力。而乙組冷凍復(fù)蘇后的前向運(yùn)動(dòng)精子百分比、精子活力均明顯高于甲組,則說(shuō)明1∶3 的精液中冷凍保護(hù)劑加入比例,能夠更好的發(fā)揮保護(hù)作用,減緩冰凍帶來(lái)的損傷,改善凍存復(fù)蘇后精子活動(dòng)力。

綜上所述,不同精液中冷凍保護(hù)劑加入比例可對(duì)冷凍復(fù)蘇后精子活動(dòng)力產(chǎn)生影響,相比于保護(hù)劑/精漿配比1∶1,配比1∶3 復(fù)蘇后精子活動(dòng)力保護(hù)的更好,下降幅度更小,減少了冷凍帶來(lái)的精子活動(dòng)力損傷。