小檗堿納米制劑的制備及表征研究

蔣蕾，孫旭，劉肖瑩，高楚雅，丁勻喬，彭海生

（哈爾濱醫科大學大慶校區藥學院，黑龍江 大慶 163319）

黃連作為常用傳統中藥，具有清熱瀉火、燥濕解毒等功效，其主要活性成分為小檗堿，近年來對小檗堿的研究不斷地深入，發現其在治療心血管疾病、糖尿病、腫瘤、炎癥及抗菌、抗病毒方面有多種藥理作用［1］，常被用于治療人體胃腸道炎癥［2］。臨床上多以小檗堿鹽酸鹽的形式應用，但是溶解度較低，并且小檗堿味道苦澀［3］，生物利用度低和潛在的副作用等，都限制了小檗堿更大范圍的應用。因此制備小檗堿納米粒以提高生物利用度和延長療效是非常有必要，并且有意義的［4］。殼聚糖（chitosan，CS）是一種生物大分子，具有無毒、黏膜黏附等作用，帶有大量的正電荷，能夠與負電荷相互結合發揮作用［5－6］。有報道稱，由于CS 能夠改善消化系統中小檗堿的細胞旁途徑，因此能夠通過細胞旁途徑增強小檗堿的吸收［7］。

納米制劑能夠有效控制藥物的釋放，相比其他藥物劑型，此法能夠避免藥物的破碎降解，并且具有良好的靶向性［8］。林愛華等［9］也以殼聚糖為材料，采用離子凝膠法制備了小檗堿殼聚糖納米粒，但為了工業化生產，筆者采用離子交聯法進行小檗堿納米制劑的制備，現報道如下。

1 材料

1.1 試劑

小檗堿（純度≥97%，批號：J1202A，大連美侖公司）；殼聚糖（批號：C8320，索萊寶公司）；三聚磷酸鈉（批號：B1926068，Aladdin 公司）；醋酸（分析純，批號：20171116，遼寧泉瑞試劑）。

1.2 儀器

精密電子天平（賽多利斯有限公司）；粒徑電位儀（Malvern instruments 公司）；磁力攪拌器（歐萊博公司）；紫外－分光光度計（南京菲勒儀器）；移液槍（德國Eooendorf公司）。

2 方法

2.1 小檗堿全波長掃描及標準曲線的制備

用紫外－可見分光光度計進行鹽酸小檗堿的全波長掃描，測定其吸收最大值在340～430 nm 之間。精密稱取小檗堿10 mg，定容至100 mL 容量瓶中，配制成0.1 mg/mL 的鹽酸小檗堿標準儲備液。分別精密量取100、500、800、1 000、1 200、1 500 μL 將其稀釋至質量濃度為1.0、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0 μg/mL，在345 nm 波長處測定各濃度下的吸光度值（A），以A 值對應的質量濃度（C）繪制標準曲線。

2.2 小檗堿與殼聚糖的比例對粒徑的影響

稱取20 mg的CS粉末緩慢溶于1%的醋酸中，配制成1 mg/mL CS－HAC溶液（pH值=5），通過0.45 μm的濾膜進行過濾，除去殘余物。稱取適量的鹽酸小檗堿粉末于蒸餾水中，配成0.5 mg/mL 的鹽酸小檗堿水溶液。通過磁力攪拌器將二者按照小檗堿/殼聚糖為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6 的比例進行混合。稱取適量的三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，STPP）固體粉末于燒杯中，配制成1.0 mg/mL STPP 溶液，緩慢地向溶液中滴加，攪拌30 min，測定各自納米粒的粒徑。

2.3 小檗堿納米粒的制備

采用離子交聯法制備殼聚糖－鹽酸小檗堿納米粒。稱取20 mg的CS粉末緩慢溶于1%的醋酸中，配制成1 mg/mL CS－HAC 溶液（pH 值= 5），通過0.45 μm的濾膜進行過濾，除去殘余物。稱取適量的鹽酸小檗堿粉末于蒸餾水中，配成0.5 mg/mL 的鹽酸小檗堿水溶液。通過磁力攪拌器將二者混合。稱取適量的STPP 固體粉末于燒杯中，配制成1.0 mg/mL STPP 溶液，緩慢地向溶液中滴加，攪拌30 min。通過Nano ZS90 型納米粒度儀對小檗堿納米粒進行粒徑、PDI 及電位的測定。

2.4 小檗堿納米粒的載藥量和包封率

取適量制備好的殼聚糖鹽酸小檗堿水分散體系納米粒于EP管中，5 000 r/min超速離心20 min。在345 nm處測定上清液的吸光度（A）值。小檗堿納米粒的包封率和載藥量公式如下：

計算其包封率和載藥量分別為90.91%、8.26%。

2.5 小檗堿納米粒的體外釋放

取2 mL 的殼聚糖－小檗堿納米粒溶液于透析袋中，采用轉籃法測定殼聚糖－小檗堿納米粒的體外釋放，其轉速為110 rpm/min，溫度為37 ℃，釋放介質為含有1%FBS 的PBS（pH 值=7.4）溶液，采取等量原則分別在0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、24 h 收集釋放液2 mL。取出的釋放液分別在波長345 nm 處測不同時間點的吸光度值。

2.6 小檗堿納米粒穩定性的考察

經上述操作制備的殼聚糖－鹽酸小檗堿納米粒放在4 ℃冰箱避光保存，分別于第1、3、5、7、10、20、30 天測定其粒徑，判斷其穩定性。

3 結果

3.1 小檗堿全波長掃描及標準曲線的制備

小檗堿在345 nm吸收值較好，因此，在此波長下采用線性回歸方程的方法繪制小檗堿標準曲線，測定其吸光度（A）值。結果，小檗堿在1.0～15.0 μg/mL 具有良好的線性關系，其標準曲線方程為Y = 0.016 9X +0.140 6，R2=0.998 5。見圖1。

圖1 小檗堿全波長掃描及標準曲線

3.2 小檗堿與殼聚糖的比例對粒徑的影響

藥物與載體的比例對殼聚糖－小檗堿納米粒粒徑的影響如圖2所示，當藥物與載體的比例為1∶1、1∶6時，未完全形成納米粒，部分藥物以溶液狀態存在；當藥物與載體的比例為1∶2、1∶4時，形成納米粒，其中當藥物與載體的比例為1∶4時，其粒徑、PDI值較小，平均粒 徑為（178.0 ± 11.4）nm，PDI 值為0.18 ± 0.09。見表2。

圖2 小檗堿與殼聚糖的比例對粒徑的影響

3.3 小檗堿納米粒的粒徑及電位

采用最佳藥物與載體的比例制備鹽酸小檗堿納米粒，其粒徑及Zeta 電位如圖3 所示，其平均粒徑為（184.8 ± 5.8）nm、PDI 值為0.17 ± 0.02、Zeta 電位為+（23.3±1.8）mV。

表1 小檗堿與殼聚糖的比例對粒徑的影響（±s）

表1 小檗堿與殼聚糖的比例對粒徑的影響（±s）

藥物/載體1∶1 1∶2 1∶4 1∶6平均粒徑（nm）618.6±10.5 306.8±9.3 178.0±11.4 450.4±6.9 PDI 0.91±0.13 0.32±0.06 0.18±0.09 0.48±0.11

圖3 小檗堿納米粒粒徑及電位

3.4 小檗堿納米粒的光學現象觀察

由圖4 可知，右側給予一束光線后，左側鹽酸小檗堿溶液未看見一條光亮“通路”，未出現丁達爾現象；右側殼聚糖－鹽酸小檗堿納米粒溶液具有丁達爾現象。

圖4 小檗堿水溶液及小檗堿納米粒水溶液的光學現象觀察

3.5 小檗堿納米粒的體外釋放

通過不同時間點的吸光值計算累積釋放量，并繪制時間－累積釋放量圖。從圖5 可知，殼聚糖－小檗堿納米粒在最初的幾個小時內有一個快速釋放的現象，其中0.5 h內累積釋放量為（28.86±3.28）%，這可能是由于吸附納米粒表面的藥物釋放所引起的，6 h內累積釋放量為（70.52±2.91）%，這一現象有利于藥物能夠快速起效。其中8～24 h均速釋放，24 h內累積釋放量為（77.92±2.18）%。

圖5 小檗堿納米粒在PBS溶液37 ℃下的體外累積釋放量

3.6 小檗堿納米粒穩定性的考察

從圖6 可知，30 d 內小檗堿納米粒粒徑波動幅度較小，其平均粒徑大小均在200 nm 左右，說明小檗堿納米粒分散均勻，沒有聚集現象出現。

圖6 小檗堿納米粒水溶液在4 ℃下30 d內的穩定性

4 討論

小檗堿是中藥黃連的主要活性成分，有著廣泛的藥理作用，如抗炎、抗菌、降壓、降血糖等［10］。隨著對其藥理作用的研究的深入，其在制劑方面的發展也越來越快［3］。小檗堿為黃色針狀結晶，顏色隨著溫度的變化而變化，具有強堿性，溶于熱水，難溶于乙醇等物理特性［11］。由于水溶性較差，口服利用度較低而限制其應用。因此本課題主要通過制備小檗堿納米制劑來增加它的應用范圍。離子交聯法是納米粒制備中的一種常用方法［12］，殼聚糖分子中的大量活性氨基在酸性介質中可以質子化形成多聚陽離子電解質，因此可以利用殼聚糖分子的正電荷和其他負電性的分子的靜電作用來制備納米粒［13］。目前離子交聯法常用的負電性分子主要有聚谷氨酸、十二烷基硫酸鈉及三聚磷酸鹽（TPP）等。

本研究利用小檗堿帶有負電荷、殼聚糖帶有正電荷，在交聯劑（三聚磷酸鈉）的作用下，采用離子交聯法制備，將其制備成小檗堿納米粒。研究表明，粒徑大小與藥物和載體的比例有關［14］，因此，有必要考察藥物與載體比例對納米粒粒徑的影響。當藥物與載體的比例為1∶1 時，由于比例過小可能會導致藥物未能完全包裹在載體內，會有大量藥物呈現游離狀態存在，未形成小檗堿納米粒，導致粒徑過大，其平均粒徑為（618.6 ±10.5）nm，PDI平均為0.91±0.13；當藥物與載體的比例為1∶6 時，其平均粒徑為（450.4±6.9）nm，PDI 平均為0.48±0.11，由于比例過大可能會由于載體自身聚集形成殼聚糖納米粒，從而影響小檗堿與載體的結合率且造成經濟方面的浪費，所以經過實驗，選定藥物與載體的比例為1∶4，其粒徑、PDI 值較小，平均粒徑為（178.0 ± 11.4）nm，PDI 值為0.18 ± 0.09。本研究成功制備了小檗堿納米制劑，并針對其進行表征，最后得出小檗堿納米制劑，改善了小檗堿藥物本身存在的問題，但是本研究存在著一定的不足之處，樣本量較少，同時也希望在之后的臨床方面能夠盡快得到應用。