cfr基因介導的耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌及其同源性研究

房鈺良，李宜雷，劉真真，劉艷飛，朱元祺1,*

(1.青島大學醫學部 檢驗系，山東 青島266071；2.青島大學附屬醫院，山東 青島266003；3.山東省日照市人民醫院，山東 日照276826)

頭狀葡萄球菌屬于條件致病菌，在自然界中分布廣泛，可引起皮膚軟組織、心內膜炎和血流等感染[1-2]。利奈唑胺為惡唑烷酮類抗菌藥物，自2000年上市以來，國內外陸續報道以凝固酶陰性葡萄球菌為主的利奈唑胺耐藥株[3-4]。頭狀葡萄球菌對利奈唑胺的耐藥機制有多種。其中，cfr基因(chloramphenicol-florfenicolresistance,氯霉素-氟甲砜霉素耐藥基因)編碼的甲基轉移酶介導的耐藥越來越引起臨床的重視，因為該基因常常位于可移動質粒上，從而使頭狀葡萄球菌通過接受外來的耐藥質粒而獲得耐藥性[5]。此外，另一個位于質粒上的耐藥optrA基因(編碼ATP結合盒轉運蛋白)也介導利奈唑胺耐藥[3]。到目前為止，關于ICU患者分離的耐利奈唑胺的頭狀葡萄球菌的報道相對較少。因此，本文對2018年6月-2019年10月分離自某醫院ICU患者血液標本的耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌進行cfr基因和optrA基因檢測，并對這些菌株之間的同源性進行研究，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株收集的利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌是2018年6月-2019年10月分離自某醫院ICU患者的血液標本，共9株，分離自9位患者。沙門菌H9812作為脈沖場電泳分子量標記菌，金黃色葡萄球菌ATCC29213為儀器藥敏質控菌株，均為本實驗室保存。cfr和optrA基因陽性對照的松鼠葡萄球菌由中國農業大學樊老師惠贈。

1.2 儀器與試劑VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統(生物梅里埃公司)。藥敏卡為GP67(梅里埃)，結果判定依據CLSI-2019標準[6]。脈沖場電泳系統CHEF-DR II和凝膠成像ChemiDoc XRS(美國BIO-RAD公司)。其他試劑為寶生物(Takara)公司。

1.3cfr和optrA基因的擴增和測序cfr基因(編碼甲基轉移酶)和optrA基因(編碼ATP結合盒轉運蛋白)的擴增依據參考文獻進行[5，7]。目的基因的PCR引物合成及擴增產物片段的測序為生工(上海)生物工程有限公司。

1.4 菌株的Sma I酶切頭狀葡萄球菌基因組脈沖場凝膠電泳脈沖場凝膠電泳具體操作參照文獻改良[8]。電泳參數：電壓6 V/cm,夾角120°，轉角時間，初始轉角4 s，終末轉角40 s，電泳時間19 h。結果判定依據Tenover規則[9]。

1.5 菌株的高通量測序基于二代Illumina和三代Nanopore測序平臺對代表性頭狀葡萄球菌QD40株進行測序。然后，對獲得的細菌基因組和質粒序列利用ResFinder等一系列軟件分析菌株的生物信息。

2 結果

2.1 菌株的藥敏和耐藥基因的擴增和測序結果

9株頭狀葡萄球菌分離株(QD31-QD37,QD40和QD41)的頭孢西丁篩選實驗都是陽性，并對青霉素、苯唑西林、紅霉素、克林霉素、環丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和利奈唑胺耐藥，但對萬古霉素、替加環素和利福平敏感，詳見表1。

PCR擴增和產物測序顯示這9株頭狀葡萄球菌都攜帶cfr基因，但未檢測到optrA基因。cfr基因的PCR擴增電泳結果見圖1。

表1 頭狀葡萄球菌臨床株的藥敏結果(μg/mL)

圖1 PCR擴增頭狀葡萄球菌cfr基因的產物電泳圖

2.2 Sma I酶切頭狀葡萄球菌基因組脈沖場凝膠電泳

Sma I酶切脈沖場凝膠電泳顯示9株頭狀葡萄球菌的電泳條帶位置大小和數目完全相同。依據Tenover規則[9]，這9株頭狀葡萄球菌屬于相同的基因型，是相同的菌株(Indistinguishable)，即暴發菌株，表明在ICU患者間存在同一克隆的流行播散。9株頭狀葡萄球菌的脈沖場凝膠電泳結果見圖2。

2.3 菌株的高通量測序結果

基于高通量測序平臺，獲得了頭狀葡萄球菌QD40株的染色質(命名為QD40-chr)和攜帶的3個質粒(分別命名為pQD40-1 ，pQD40-2和pQD40-3)的全序列。經軟件分析顯示：染色質QD40-chr攜帶了erm(A),aac(6′)-aph(2″),aadD,ant(9)-Ia和mecA耐藥基因；頭狀葡萄球菌QD40株攜帶3個質粒，其中質粒pQD40-3大小為39 504 bp，攜帶了cfr基因。菌株的高通量測序分析結果詳見表2。

3 討論

隨著利奈唑胺在臨床感染治療中的應用，對利奈唑胺耐藥病原菌的報道越來越多，并以凝固酶陰性葡萄球菌為主[1,3]。對利奈唑胺耐藥的機制為：①23S rRNA V區基因突變；②核糖體蛋白L3和L4突變；③甲基轉移酶(由cfr基因編碼)介導的耐藥;④ATP結合盒轉運蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC,由optrA基因編碼)介導的耐藥[10]。

圖2 Sma I酶切頭狀葡萄球菌基因組脈沖場凝膠電泳

表2 頭狀葡萄球菌QD40株的染色質和攜帶質粒的生物信息分析

本研究中，9株頭狀葡萄球菌經PCR擴增和產物測序顯示都攜帶cfr基因，而且高通量測序進一步驗證在頭狀葡萄球菌QD40中，該基因位于大小為39 504bp的質粒pQD40-3上，而且該質粒同時攜帶aac(6′)-aph(2″)基因。另外，在頭狀葡萄球菌QD40中，染色質QD40-chr上攜帶了erm(A)、 aac(6′)-aph(2″)、 aadD、ant(9)-Ia和mecA耐藥基因，而質粒pQD40-1和pQD40-2分別攜帶qacA基因和blaZ基因。此外，這些菌株的藥敏實驗顯示頭孢西丁篩選實驗陽性，并對青霉素、苯唑西林、大環內酯類和喹諾酮類耐藥。以上結果表明，這9株頭狀葡萄球菌的耐藥表型與基因型相一致，即菌株呈現的多重耐藥表型與其攜帶的耐藥基因相符合。

來自牛體內的松鼠葡萄球菌分離株攜帶的cfr基因是2000年由Schwarz首先報道[11]。而位于腸球菌屬質粒上的optrA基因最初是Wang等[7]于2015年報道。由于cfr基因和optrA基因常常位于質粒上，使病原菌容易獲得性耐藥，并導致醫院感染的流行或暴發[10]。依據Tenover規則[9]，本研究的9株頭狀葡萄球菌有相同的PFGE圖，提示這些菌屬于相同的基因型，是相同的菌株(Indistinguishable)，即暴發菌株，這表明在ICU患者之間存在相同克隆的暴發流行。此外，不同種的葡萄球菌也可對利奈唑胺耐藥，也可引起醫院感染暴發。如，García報道了由利奈唑胺耐藥的金黃色葡萄球菌引起的ICU患者之間的醫院感染暴發流行[12]，而Kelly則報道由利奈唑胺耐藥的表皮葡萄球菌在ICU導致的克隆暴發[13]。因此，質粒攜帶cfr基因的葡萄球菌容易在住院患者之間傳播，引起醫院感染暴發流行，這應引起臨床重視。

有研究表明，細菌對利奈唑胺耐藥與長期使用該藥引發選擇性壓力下的耐藥有關[10]。通過回顧性分析9株頭狀葡萄球菌分離株來源患者的臨床資料，發現這些患者都曾經接受利奈唑胺的抗感染治療。與我們研究相同的是，Yang于2013年報道[14]在兩所醫院出現攜帶cfr基因的對利奈唑胺耐藥凝固酶陰性葡萄球菌，也是因為這些患者接受了利奈唑胺的治療。同樣，楊洋于2017年也報道2例患者在使用利奈唑胺治療2 周期間出現了頭狀葡萄球菌耐藥株[15]。因此，臨床在使用利奈唑胺治療時，需要謹慎延長治療時間并要動態監測菌株的耐藥性。

optrA基因編碼的ATP結合盒轉運蛋白可介導噁唑烷酮類耐藥或MIC升高[7，10]。有研究顯示，optrA基因可以在腸球菌屬之間傳遞，甚至在體外實驗中可以傳遞到金黃色葡萄球菌，但是，關于葡萄球菌臨床株攜帶oprtA基因的報道非常少。在本研究中，也未發現這9株頭狀葡萄球菌攜帶optrA基因。

總之，攜帶cfr基因的頭狀葡萄球菌容易引起醫院感染的暴發流行，在臨床抗感染治療時尤其要注意利奈唑胺使用的療程，并要動態監測耐藥性的發展。