蒙藥驗方《亞日飲湯》提取物對H37RV感染小鼠血清IL-12的影響

布仁特古斯，陸 宇，馬媛媛，照 娜，烏日古瑪拉，圖門烏力吉*

(1.內蒙古醫科大學蒙醫藥學院，內蒙古 呼和浩特010010;2.北京市胸科醫院 藥物實驗室;3.內蒙古醫科大學附屬醫院 蒙醫科)

結核病是嚴重危害人類健康的慢性傳染病，其治療以化學藥物治療殺滅結核分枝桿菌為主[1]。機體在清除結核分枝桿菌過程中CD4+Th1和CD8+T細胞介導的細胞免疫及其分泌的細胞因子如IFN-γ、IL-12起重要作用[2]。研究顯示中醫藥在減輕抗結核藥物毒副作用、逆轉結核桿菌耐藥情況以及抑菌、調整感染結核分枝桿菌的免疫水平方面取得了很好的療效[3]。經臨床對照研究發現《亞日飲湯》具有輔助治療肺結核作用,在體內具有一定的抗結核桿菌活性[4]，其作用機理至今不清。研究發現該藥體外并無抗結核桿菌作用，其代謝產物亦無直接抑制結核桿菌作用[5]。對于結核病體液免疫并無保護作用[6]，因此，認為該藥可能通過提高機體細胞免疫功能來發揮治療結核病作用的。結核病的發病與多種免疫細胞和細胞因子相關，IL-12是與結核病細胞免疫關系最密切的細胞因子之一[7]，故本研究通過氣溶膠建立H37RV感染小鼠模型，給予亞日飲湯治療后，采用ELISA法測定血清IL-12的水平，間接了解該藥對細胞免疫功能的影響，預期揭示該藥的可能作用機理。

1 材料與方法

1.1 試劑去離子水、1×PBS、2N H2SO4、吐溫-20。ELISA檢測試劑盒ELISA MAXTMDeluxe Set Mouse IL-12 kit購于Biolegend公司。包被板ELISA MAXTMUncoted Plates購于Biolegend公司。密封膜、1.5 ml離心管。

1.2 方法

氣溶膠感染制備小鼠急性結核病模型，BALB/C小鼠，雄性，體重18-20 g，60只，分空白組;模型組;異煙肼組;亞日飲湯高、中、低劑量組，共6組，每組10只。亞日飲湯提取物小鼠灌胃高劑量每日每只216 mg一次灌胃，中劑量組每日每只108 mg一次灌胃，低劑量組每日每只54 mg一次灌胃，陽性藥物組(異煙肼)20 mg/kg·天，空白組和模型組給予相同體積生理鹽水(不超過1 ml)每日1次，造模后治療28天。取腹主動脈血1 ml，室溫靜置凝血后以離心半徑 3 cm，3 000 r/min離心20 min，取上清，滅活后過濾除菌保存，采用ELISA方法檢測小鼠血清中IL-12，實驗步驟按照“ ELISA MAXTM Deluxe Set Mouse IL-12 ”檢測試劑盒說明書進行。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 制作標準曲線標準品OD450-OD570差值的均值及濃度值見表1。以標準品OD450-OD570差值的均值為橫坐標，濃度為縱坐標，通過散點圖添加趨勢線的方法，制作標準曲線見圖1。

表1 標準品OD450-OD570差值的均值及濃度值(pg/ml)

圖1 血清IL-12標準曲線圖

2.2 根據標準曲線計算樣品濃度以OD450—OD570的差值為x值，代入標準曲線y=383.9x2+337.3x-7.124，y值即為樣品濃度見圖2。模型組、亞日飲湯高、中、低劑量組的水平高于空白組、異煙肼組(P<0.05)，亞日飲湯高、中、低劑量組的水平高于模型組(P<0.05)。見表2。

圖2 血清IL-12

表2 血清IL-12濃度在空白組、模型組、異煙肼組、亞日飲湯組表達水平比較

3 討論

結核分支桿菌感染機體后是否發病取決于結核桿菌的數量、毒力和機體的免疫狀態。細胞免疫在抗結核保護性免疫中起主要作用[8]。IL-12是由p40和p35亞基(p35/p40)組成的異二聚體細胞因子，IL-12的p40亞基是巨噬細胞趨化因子，可將巨噬細胞趨化到炎癥部位或腫瘤部位而增強固有免疫應答作用[9-10]。IL-12在抗結核的固有性免疫和適應性免疫中都發揮著關鍵性的生物學功能，結核桿菌對IL-12 p40亞基起到誘導作用，缺乏此細胞因子的人群對結核桿菌有明顯的易感性[11]。Th1細胞是機體抗結核最重要的免疫細胞，IL-12主要通過對Th1細胞進行調節而參與抗結核的免疫反應，Th0向Th1分化中IL-12起到了無可取代的作用[12]。IL-12 p40對于針對結核分枝桿菌的保護性IFN-γ反應是絕對必需的，感染結核桿菌時機體巨噬細胞免疫功能低下，p40的生成減少，所以導致IL-12分泌減少，從而影響Th1細胞的生成分化，導致Th1/Th2細胞的表達失衡[13]。體內IL-12缺乏時,能導致結核桿菌在靶器官中持續生長繁殖[14]。本研究結果顯示亞日飲湯高、中、低劑量組血清IL-12的水平高于空白組、模型組、異煙肼組(P<0.05)，表明亞日飲湯具有提高小鼠血清IL-12水平的作用，異煙肼組水平低于空白組，可能與異煙肼屬于一線抗結核藥物，具有直接殺傷結核桿菌作用，并非與提高免疫功能有關，空白組水平低于模型組，因空白組未曾受到H37RV感染，故只表現出固有免疫狀態，模型組水平高于空白組和異煙肼組，是因模型組受到H37RV感染后，血清IL-12水平有所升高，表明小鼠原有免疫狀態，但其水平升高明顯不及亞日飲湯組。IL-12在免疫應答早期階段誘導CD4+T細胞，自然殺傷(NK)細胞和NKT細胞產生IFN-γ[15-16]。IL-12具有刺激IFN-γ分泌作用，IFN-γ水平升高是否是通過提高IL-12水平來實現的有待于進一步研究。本研究另一項結果顯示亞日飲湯具有提高小鼠血清IFN-γ水平的作用，與上述研究結果一致，二者的關聯需進一步研究。綜上，認為亞日飲湯可以提高H37RV感染小鼠模型血清中的IL-12水平，可能是亞日飲湯治療結核病作用機制之一。