負(fù)載血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的鄰苯二酚殼聚糖體外藥物緩釋性能及抗菌性研究

韓佳岐，田 瑗，姜 秋*,袁文錦，楊 婕，董 寧

(1.吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 兒童口腔科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 健康管理中心，吉林 長(zhǎng)春130033)

年輕恒牙常因齲病、牙外傷或發(fā)育異常等導(dǎo)致牙髓感染壞死，牙根發(fā)育停止。牙髓組織工程再生是一種有潛力的多學(xué)科治療方法，對(duì)于應(yīng)用于牙髓組織工程再生中的支架材料，在生物相容性、藥物負(fù)載性能、機(jī)械性能以及降解性等方面均有要求[1]，此外，還應(yīng)考慮血運(yùn)重建、細(xì)胞-基質(zhì)相互作用、再礦化和抗菌性[2]等。殼聚糖是一種具有良好生物相容性，生物降解性和廣譜抗菌性[3]的天然多糖，但在中性pH溶劑中溶解度低使其應(yīng)用范圍受限[4]。有研究用鄰苯二酚對(duì)殼聚糖進(jìn)行改性[5-6]，使殼聚糖在中性pH溶液中溶解性顯著提高，生物相容性和親水性得到優(yōu)化，避免了負(fù)載重組蛋白等生物大分子藥物時(shí)支架的低pH使藥物變性。另外，鄰苯二酚殼聚糖在組織表面有很強(qiáng)的黏附性[7-8]，不僅植入根管后可以附著在根管壁上，提供較穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)支撐，還能促進(jìn)細(xì)胞黏附。

血運(yùn)重建是牙髓組織再生的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)，大量研究表明血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)在再生醫(yī)學(xué)中起促血管生成的作用。然而VEGF在體內(nèi)半衰期短，加入支架中則可以避免其在體內(nèi)快速降解，提升療效[9-10]。本課題組前期體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，改性后水凝膠具有更好的促進(jìn)細(xì)胞黏附性能[11]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)鄰苯二酚殼聚糖水凝膠與生物應(yīng)用相關(guān)的物理性能進(jìn)行表征，并研究其對(duì)VEGF的控釋性能以及抗菌性，以構(gòu)建理想的牙髓再生支架材料。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器殼聚糖(分子量50-190 kDa)、京尼平、3-(3,4-二羥基苯基)丙酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)(Sigma Aldrish 公司，美國(guó))； VEGF(Proteintech公司，美國(guó))；滲析袋(3500W)(Biosharp公司，中國(guó))；酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，中國(guó))；哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基(溫州康泰生物科技有限公司，中國(guó))；腦心浸液肉湯培養(yǎng)基、維生素K1(青島海博生物技術(shù)有限公司，中國(guó))；瓊脂粉、氯化血紅素(上海生工生物科技有限公司，中國(guó))；傅里葉紅外光譜儀(Bruker公司，美國(guó))；酶標(biāo)儀(Bio-TEK公司，中國(guó))；恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO公司，日本)；無(wú)菌超凈臺(tái)(安泰技術(shù)有限公司，中國(guó))；旋轉(zhuǎn)流變儀(Discovery HR-2，TA Instrument，美國(guó))；接觸角測(cè)定儀(DataPhysics Instruments，美國(guó))。

1.2 EDC偶聯(lián)法制備鄰苯二酚殼聚糖配制60 ml 1%(w/v)殼聚糖溶液，調(diào)節(jié)溶液pH值至5.0。稱取 0.145 g 3-(3,4-二羥基苯基)丙酸溶于15 ml乙醇中，0.356 g EDC溶于15 ml去離子水，將兩種溶液混合，在攪拌下快速加入到殼聚糖溶液中，隨后調(diào)節(jié)pH值至4.8，避光繼續(xù)攪拌18 h后，將反應(yīng)溶液置于滲析袋(3 500 w)內(nèi)，在pH=5的酸化去離子水中滲析3天[12]，冷凍干燥24 h，得到鄰苯二酚殼聚糖凍干樣品，化學(xué)合成反應(yīng)式見(jiàn)圖1。

圖1 鄰苯二酚殼聚糖合成反應(yīng)式

1.3 載有VEGF的水凝膠的制備將適量的VEGF蛋白溶液加入鄰苯二酚殼聚糖溶液中(最終VEGF濃度為100 ng/ml)，混勻后，滴加2%京尼平的乙醇溶液(殼聚糖與京尼平的質(zhì)量比為 10∶1)，攪拌30 min，放于恒溫恒濕箱中交聯(lián)1 d，得到鄰苯二酚殼聚糖VEGF復(fù)合水凝膠。

1.4 性能表征

1.4.1紅外光譜檢測(cè) 使用傅里葉紅外光譜儀對(duì)殼聚糖和鄰苯二酚殼聚糖進(jìn)行分析，確定鄰苯二酚成功接枝到殼聚糖上。

1.4.2流變性分析 使用旋轉(zhuǎn)流變儀對(duì)水凝膠的力學(xué)性能逆行表征。室溫下，采用震蕩應(yīng)變?yōu)?%，振蕩頻率為1 Hz的振幅掃描檢測(cè)殼聚糖和鄰苯二酚殼聚糖水凝膠的儲(chǔ)能模量(G’)和損耗模量(G”)隨時(shí)間的變化情況。

1.4.3接觸角測(cè)試 通過(guò)接觸角測(cè)定儀檢測(cè)充分溶脹前后殼聚糖和鄰苯二酚殼聚糖水凝膠的水接觸角，分析其親水性。在室溫下使用懸滴法滴加2 μl去離子水于水凝膠表面，捕獲水凝膠表面上水滴的圖像，并對(duì)獲得的圖像進(jìn)行計(jì)算與分析。為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，在每個(gè)樣品表面的三個(gè)不同點(diǎn)重復(fù)測(cè)量，求得接觸角的平均值。將殼聚糖和鄰苯二酚殼聚糖的平均接觸角值進(jìn)行比較。

1.5 藥物體外緩釋試驗(yàn)一定量的載藥水凝膠浸于PBS中，設(shè)置三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組，分別于0.5天，1.5天，2.5天，3.5天，4.5天，5.5天，6.5天，7.5天，9.5天，11.5天，13.5天，15.5天，18.5天和21.5天的特定時(shí)間點(diǎn)，取1 ml上清液保存，并將剩余液體全部吸出，重新注入等體積PBS。ELISA法繪制VEGF標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定樣品中VEGF濃度，計(jì)算釋放率，繪制緩釋曲線。

1.6 抗菌性能測(cè)試大腸桿菌(ATCC25539，購(gòu)于湖南豐暉生物科技有限公司)和具核梭桿菌(ATCC25586，購(gòu)于上海保藏生物技術(shù)中心)用作試驗(yàn)菌，以評(píng)估水凝膠的體外抗菌活性。

1.6.1抑菌環(huán)法 在固體培養(yǎng)皿上涂布100 μl細(xì)菌懸浮液(1×108cfu/ml)，將水凝膠置于培養(yǎng)皿上，37℃溫育24小時(shí)。通過(guò)觀察水凝膠表面及周圍有無(wú)細(xì)菌區(qū)來(lái)定性測(cè)定水凝膠對(duì)細(xì)菌的抑制作用。

1.6.2菌落計(jì)數(shù)法 將200 μl水凝膠與1 ml細(xì)菌懸浮液(106cfu/ml)混合放入5 ml EP管中，不加樣品作為空白對(duì)照組。將EP管在37℃培養(yǎng)箱中孵育22-24 h后，對(duì)菌液進(jìn)行連續(xù)稀釋至1萬(wàn)—10萬(wàn)倍，取100 μl稀釋后菌液涂布于固體培養(yǎng)基，孵育24 h，通過(guò)計(jì)算菌落數(shù)定量測(cè)定水凝膠的抑菌率(BR)。

抑菌率計(jì)算公式：BR=(B-A)/B×100%，式中：A為實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù)；B為對(duì)照組菌落數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用PASW 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，菌落計(jì)數(shù)結(jié)果滿足正態(tài)分布與方差齊性，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅外光譜分析圖2為殼聚糖與鄰苯二酚殼聚糖的紅外光譜圖。從殼聚糖紅外光譜圖中可以看到1 154 cm-1處和1 184 cm-1處為殼聚糖中典型的C-O的伸縮振動(dòng)吸收峰，1 658 cm-1和1 613 cm-1分別對(duì)應(yīng)酰胺Ⅰ基和酰胺Ⅱ基的振動(dòng)吸收峰。與殼聚糖相比，鄰苯二酚殼聚糖的譜圖在波長(zhǎng)1 500 cm-1-1 700 cm-1處出現(xiàn)明顯差異：在1 523 cm-1處出現(xiàn)了新的吸收峰，為芳香族C=C骨架的振動(dòng)吸收峰[12]，證明鄰苯二酚成功接枝到殼聚糖分子上。

2.2 流變性分析圖3為殼聚糖與鄰苯二酚殼聚糖水凝膠流變性能圖，在頻率為1 Hz的振蕩下，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，殼聚糖與鄰苯二酚殼聚糖的水凝膠材料的儲(chǔ)能模量(G’)始終大于損耗模量(G”)，證明材料始終處于凝膠狀態(tài)。并且鄰苯二酚改性后殼聚糖的G’顯著提高，從3 000 Pa增加到13 000 Pa，G”也具有類似的變化趨勢(shì)。表明鄰苯二酚殼聚糖比殼聚糖具有更好的彈性性能，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

2.3 親水性檢測(cè)去離子水液滴和水凝膠表面之間測(cè)得的接觸角能反映材料表面潤(rùn)濕性。接觸角值越小，表明材料表面的潤(rùn)濕性越高，親水性也越強(qiáng)。如圖4所示，接觸角測(cè)試中，當(dāng)水滴與充分溶脹前的鄰苯二酚殼聚糖水凝膠表面接觸時(shí)，水滴瞬間鋪展，被水凝膠吸收；而溶脹前殼聚糖的水接觸角為24.0°±0.5°，具有一定的親水性，但其性能低于改性后殼聚糖。充分溶脹3天后，鄰苯二酚殼聚糖和殼聚糖的水接觸角分別為15.9°±2.7°和67.2°±2.9°，雖均有升高，但鄰苯二酚殼聚糖的水接觸角仍明顯低于殼聚糖。以上結(jié)果表明鄰苯二酚改性后殼聚糖的親水性得到顯著提高。

圖2 殼聚糖和鄰苯二酚殼聚糖紅外光譜圖(CS：殼聚糖；Cat-CS：鄰苯二酚殼聚糖。Cat-CS的譜圖在波長(zhǎng)1 523 cm-1處出現(xiàn)芳香族C=C骨架的振動(dòng)吸收峰，證明鄰苯二酚成功接枝到殼聚糖分子上。)

圖3 殼聚糖與鄰苯二酚殼聚糖水凝膠流變變化情況(Cat-CS的G’和G”均比CS顯著提高，G’從3 000 Pa增加到13 000 Pa。)

2.4 體外緩釋行為用ELISA法檢測(cè)梯度稀釋的VEGF標(biāo)準(zhǔn)品(濃度分別為800 pg/ml、400 pg/ml、200 pg/ml、100 pg/ml、50 pg/ml、0 pg/ml)在波長(zhǎng)為450 nm處的吸光度，繪制VEGF標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5A)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式為y=0.066 81 + 0.001 87x，樣品線性回歸于預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.992 7。

通過(guò)ELISA試劑盒檢測(cè)在21天中的特定時(shí)間點(diǎn)吸取的上清液的實(shí)際濃度。得到鄰苯二酚殼聚糖水凝膠的藥物累積釋放量和累積釋放率。從藥物累積釋放曲線(圖5B)可以看出，前15天的每日藥物釋放量基本穩(wěn)定，其中，5.5天至15.5天較前5天輕微放緩；最后一周曲線趨勢(shì)逐漸趨近平緩，藥物釋放速率逐漸減慢，但并未停止釋放。21天時(shí)藥物累積釋放率達(dá)到52.95 %。以上結(jié)果表明鄰苯二酚殼聚糖水凝膠對(duì)藥物有良好的控釋作用，并且可以達(dá)到較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定釋放。

圖4 溶脹前后的殼聚糖水凝膠與鄰苯二酚殼聚糖水凝膠接觸角變化情況(溶脹前后Cat-CS的水接觸角均小于CS，Cat-CS親水性優(yōu)于CS。)

圖5 鄰苯二酚殼聚糖水凝膠藥物緩釋性能 (A:VEGF標(biāo)準(zhǔn)曲線;B:藥物累積釋放曲線;21天內(nèi)載有VEGF的鄰苯二酚殼聚糖持續(xù)釋放VEGF。)

2.5 體外抗菌性能微生物感染會(huì)阻礙牙髓再生過(guò)程，因此水凝膠具有抗菌能力十分重要。使用傷口感染的常見(jiàn)菌E.coli和根管感染中常見(jiàn)的革蘭氏陰性厭氧菌F.n評(píng)估水凝膠的抗菌能力。如圖6A所示，鄰苯二酚殼聚糖水凝膠表面及周圍一定范圍內(nèi)未見(jiàn)E.coli或F.n生存。水凝膠對(duì)E.coli和F.n的抑制區(qū)直徑分別為約13.5 mm和14.8 mm。

通過(guò)抑菌率的計(jì)算可以定量體現(xiàn)出水凝膠的抗菌性的強(qiáng)弱。水凝膠對(duì)E.coli和F.n處理24小時(shí)后菌落形成單位較空白對(duì)照組相比均有明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(E.coli組：t=82.814，P<0.05；F.n組：t=16.704，P<0.05)。E.coli的24小時(shí)抑菌率為93.8%，對(duì)F.n的抑菌率為86.7%，說(shuō)明殼聚糖改性產(chǎn)物具有比較優(yōu)異的抗菌性。

圖6 鄰苯二酚殼聚糖水凝膠抗菌性能(A：抑菌環(huán)法檢測(cè)鄰苯二酚殼聚糖水凝膠對(duì)E.coli與F.n的抗菌性,水凝膠在兩種細(xì)菌的固體培養(yǎng)基上均可形成明顯的抑菌環(huán)；B：菌落計(jì)數(shù)法檢測(cè)鄰苯二酚殼聚糖水凝膠對(duì)E.coli與F.n抗菌性,兩種細(xì)菌菌液分別培養(yǎng)24 h后，加入水凝膠組的菌落計(jì)數(shù)明顯少于空白對(duì)照組。)

3 討論

牙髓組織工程再生中的支架材料有許多性能要求，比如在機(jī)械性能方面，支架材料的彈性模量會(huì)對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞的分化產(chǎn)生影響，如血管等軟組織再生需要支架材料的彈性模量約為2-15 kPa[13]。殼聚糖及其衍生物作為天然生物材料滿足組織支架的基本要求和特性。由于存在氨基和兩個(gè)羥基官能團(tuán)，殼聚糖可以進(jìn)行許多反應(yīng)，例如醚化，酯化，交聯(lián)等，以此進(jìn)行化學(xué)和機(jī)械修飾，通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾賦予所需的特性和功能[14]。因此，盡管殼聚糖僅能在酸性條件下溶解使其應(yīng)用受限，但可以通過(guò)引入水溶性材料的親水部分等方法提高溶解度[15-16]。本研究中，通過(guò)EDC偶聯(lián)反應(yīng)引入鄰苯二酚基團(tuán)對(duì)殼聚糖進(jìn)行改性，紅外光譜檢測(cè)顯示鄰苯二酚基團(tuán)成功接枝到殼聚糖長(zhǎng)鏈上，改性后殼聚糖可以在中性條件下溶解，在溶液中加入京尼平交聯(lián)劑后形成鄰苯二酚殼聚糖水凝膠，流變性分析結(jié)果顯示在頻率為1Hz的振蕩下，水凝膠的G’和G”基本未發(fā)生變化，表明已形成了結(jié)構(gòu)性質(zhì)較穩(wěn)定的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，此外流變數(shù)據(jù)也顯示出鄰苯二酚殼聚糖的彈性性能比純殼聚糖水凝膠更好。

在牙髓組織工程學(xué)中，直接將干細(xì)胞注射到根管內(nèi)的再生能力很差，還需要活性細(xì)胞因子促進(jìn)細(xì)胞定居及其基質(zhì)沉積，因此，將活性生物分子載入具有控釋性能的支架內(nèi)對(duì)于它們?cè)谑軗p組織內(nèi)的遞送以及對(duì)細(xì)胞的作用至關(guān)重要。VEGF可以通過(guò)其受體介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，改變血管通透性，這些功能在血管生成的初期發(fā)揮重要作用，另外VEGF還具有干細(xì)胞募集的功能。但VEGF在體內(nèi)的半衰期很短，向缺血部位局部注射或系統(tǒng)注射重組VEGF蛋白溶液的臨床效果并不理想[6]，因此，人們一直在探究親水性藥物在水凝膠支架中的緩釋效果和應(yīng)用。本研究中，溶脹前后的鄰苯二酚殼聚糖水凝膠的水接觸角為0°和15.9°±2.7°，均較殼聚糖水凝膠明顯減小，說(shuō)明鄰苯二酚殼聚糖水凝膠具有更高親水性、含水性和更優(yōu)的生物相容性。鄰苯二酚對(duì)殼聚糖的修飾在載藥和緩釋方面的影響主要為：(1)改善殼聚糖的水溶性，避免酸性條件下VEGF變性，材料的生物相容性也有所提升；(2)對(duì)殼聚糖水凝膠親水性的改善，進(jìn)而增加水溶性VEGF的負(fù)載，并提高材料通透性。因此，鄰苯二酚殼聚糖水凝膠在親水性藥物的控釋載體應(yīng)用方面更具優(yōu)勢(shì)。之前的研究表明[6]，應(yīng)用于口腔黏膜給藥的鄰苯二酚殼聚糖水凝膠具有持續(xù)遞送藥物的能力。本實(shí)驗(yàn)在鄰苯二酚殼聚糖水凝膠的合成過(guò)程中將VEGF混合其中，水凝膠網(wǎng)絡(luò)的交聯(lián)和藥物負(fù)載同時(shí)進(jìn)行，VEGF以溶液的形式均勻分散在水凝膠基質(zhì)中并吸附于支架上，作用力為物理吸附的范德華力。本實(shí)驗(yàn)采用ELISA對(duì)37℃、中性pH環(huán)境下水凝膠對(duì)VEGF的累積控釋進(jìn)行了檢測(cè)，載藥水凝膠持續(xù)緩慢穩(wěn)定地釋放藥物，未見(jiàn)突釋現(xiàn)象，21天時(shí)累積釋放率達(dá)52.95%，表明鄰苯二酚殼聚糖水凝膠具有藥物緩釋能力。在親水性藥物均勻分布于水凝膠基質(zhì)中的控釋系統(tǒng)中，最常見(jiàn)藥物釋放機(jī)制是擴(kuò)散，藥物到達(dá)水凝膠表面附近即可釋放出來(lái)，而水凝膠內(nèi)部的藥物擴(kuò)散到表面需要一定時(shí)間，因此VEGF釋放速率在實(shí)驗(yàn)后期逐漸減低。有研究將殼聚糖/β-甘油磷酸酯(CS/β-GP)水凝膠作為VEGF緩釋體系，使用ELISA檢測(cè)VEGF的8日釋放曲線。結(jié)果顯示前4天VEGF的每日釋放量逐漸增加。從第4天開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，8天后累積釋放量趨于峰值，共有12%的VEGF蛋白從水凝膠中釋放出來(lái)[17]。本實(shí)驗(yàn)中前15天內(nèi)藥物釋放量均較穩(wěn)定，21日累積釋藥量略低，可能由于材料適中的機(jī)械強(qiáng)度提高了藥物在水凝膠網(wǎng)絡(luò)中的捕獲能力[18]，并且有部分VEGF可能與鄰苯二酚殼聚糖發(fā)生了交聯(lián)，結(jié)合在水凝膠網(wǎng)絡(luò)中，僅通過(guò)擴(kuò)散作用無(wú)法釋放。

大多數(shù)牙髓和根尖周疾病是由于口腔細(xì)菌的直接或間接參與而誘發(fā)的。一項(xiàng)系統(tǒng)回顧顯示，79%牙髓再生失敗的臨床病例是由于持續(xù)感染[19]，這表明控制根管中的細(xì)菌是再生治療中關(guān)鍵的步驟。牙髓血運(yùn)重建治療中，消毒主要依靠沖洗和根管內(nèi)封藥的化學(xué)消毒，只有極少或沒(méi)有機(jī)械預(yù)備，會(huì)導(dǎo)致根管內(nèi)細(xì)菌殘留。這些殘留的細(xì)菌可以抑制干細(xì)胞分化，影響組織形成和再生過(guò)程的成功。因此，在不影響細(xì)胞功能的情況下，提高支架材料的抗菌效果，會(huì)提高再生牙髓治療過(guò)程的成功率。

根管感染中常見(jiàn)革蘭氏陰性厭氧菌，其細(xì)胞壁富含脂多糖，與革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)不同，這導(dǎo)致不同菌種對(duì)殼聚糖具有不同的敏感性。有研究表明，革蘭氏陰性菌對(duì)殼聚糖的敏感性可能高于革蘭氏陽(yáng)性菌[20]。本研究使用兩種革蘭氏陰性菌即E.coli和F.n測(cè)試鄰苯二酚改性后殼聚糖水凝膠的抗菌性能，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示鄰苯二酚殼聚糖水凝膠具有良好的抗菌性，對(duì)兩種細(xì)菌均可形成一定范圍的抑制區(qū)域，并對(duì)浮游細(xì)菌的抗菌率分別達(dá)到93.8%和86.7%，抗菌率未達(dá)95%以上可能因?yàn)橐豚彵蕉踊鶊F(tuán)消耗了殼聚糖中的部分氨基，減弱了正電荷效應(yīng)，使抗菌性能稍有減弱[12]。以往純殼聚糖及其衍生物的抗菌應(yīng)用大多是作為抗生素遞送載體，有研究報(bào)道殼聚糖-植物化學(xué)偶聯(lián)物與紅霉素等抗生素協(xié)同表現(xiàn)出很強(qiáng)的抗菌活性[21]，但也有研究發(fā)現(xiàn)載有抗生素的殼聚糖水凝膠會(huì)對(duì)牙髓干細(xì)胞的礦化活性產(chǎn)生不利影響[22]。

綜上所述，本研究中成功制備出負(fù)載VEGF的鄰苯二酚改性殼聚糖水凝膠，是一種具有良好親水性和適宜的彈性模量的支架材料，具有緩釋細(xì)胞因子和抗菌的雙重功能，仍需要進(jìn)一步對(duì)其抗菌機(jī)制和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)血管再生進(jìn)行探索。