基于煙草水提物的Maillard 反應產物影響因素

徐秀娟，茅中一，楊春強，伊勇濤，周培琛，胡 軍，謝金棟，史清照*，張 峰*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2 號 450001

2. 福建中煙工業有限責任公司技術中心，福建省廈門市集美區濱水路298 號 361021

Maillard反應能生成與食品香味、色澤等相關的羧酸類、酮類、吡喃類、吡嗪類、吡咯類和吡啶類等化合物，以及類黑精等大分子物質［1-3］。由于Maillard反應在煙葉的調制、陳化、加工和燃吸期間均會發生，是煙草特征香味形成的主要來源之一，因而Maillard 反應在煙草增香方面的應用研究受到廣泛關注［4-6］。采用特定氨基酸與糖的模型體系制備煙用香料以改善煙草制品的感官品質已有較多文獻報道［7-11］，但存在香氣單一、與卷煙協調性略差等問題。為提高天然香料在卷煙加料中的作用效果，以天然植物提取物為糖源或氮源，通過Maillard反應制備煙用香料的方法逐漸涌現［12-15］。煙草中還原糖質量分數較高，利用煙草自身的還原糖與氨基酸進行Maillard反應制備煙用香料，可達到提高不適用煙葉的利用率、提高煙葉使用價值的目的。然而，目前的報道多以不同反應條件下反應產物的感官作用差異為主，而對反應產物中香韻特征成分的關鍵影響因素，及其與卷煙感官作用的相關關系研究較少。因此，為充分利用煙葉資源，以亞臨界萃取后煙葉殘渣制備的煙草水提物為糖源，系統考察了不同氨基酸、糖/氨基酸摩爾比和反應時間等對反應產物中18 種特征香味成分質量分數的影響，旨在為Maillard反應產物的定向控制提供參考，同時為煙葉的綜合利用提供技術思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

福建尤溪YLC02-2016 片煙由福建中煙工業有限責任公司提供。

L-谷氨酸（99%）、L-天門冬氨酸（99%）、L-脯氨酸（99%）、糠醛（≥99.5%）、3-甲基-1，2-環戊二酮（98%）、2，5-二甲酰基呋喃（＞98%）和5-羥甲基糠醛（＞99%）［阿拉丁試劑（中國）有限責任公司］；丙酸蘇合香酯（98%，內標）、5-乙酰氧基甲基-2-糠醛（＞98%）（美國Acros Organics 公司）；2-甲基四氫呋喃-3-酮（98%）、5-甲基糠醛（99%）和4-環戊烯-1，3-二酮（95%）（美國Sigma-Aldrich公司）；3-羥基-2-丁酮（＞98%）和3-乙酰基吡啶（＞98%）［梯希愛（上海）化成工業發展有限公司］；羥基丙酮（95%）（北京百靈威科技有限公司）；N-甲基-2-吡咯甲醛（98%）（美國Alfa Aesar公司）；糠醇（98%）和2-乙酰基吡咯（98%）（上海安耐吉化學有限公司）；2（5H）-呋喃酮（97%）、4-羥基-2，5-二甲基-3（2H）-呋喃酮（97%）（美國Ark Pharm公司）。

7890A/5975C 氣相色譜-質譜聯用儀（美國Agilent 公司）；CP224S 型電子天平（感量0.000 1 g，德國Sartorius公司）；HY-5型振蕩器（金壇市中大儀器廠）；尼龍66 濾膜（0.22 μm，天津津騰公司）；一次性使用無菌注射器（1 mL，河南曙光健士醫療器械集團有限公司）；Easymax 102 合成反應器（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 煙草水提物的制備

將煙葉粉碎后，采用亞臨界萃取法進行一級萃取（溶劑為二甲醚，夾帶劑為95%乙醇，m二甲醚∶m乙醇=1∶0.05，m煙葉∶m二甲醚=1∶20，萃取時間為20 min，萃取3次），萃取后的煙葉以水為溶劑進行二級萃取（m煙葉∶m二甲醚=1∶10，加熱溫度為60 ℃，萃取時間為3 h，萃取2 次）。萃取結束后，合并兩次萃取液，在體系壓力0.01 MPa、水浴35 ℃條件下濃縮至折光指數（20 ℃）為1.427 8，相對密度（20 ℃）為1.243 0。

1.2.2 Maillard反應產物的制備

稱取10 g 煙草水提物和適量氨基酸，轉移至玻璃反應管中，攪拌速度為800 r/min，在物料溫度為110 ℃條件下反應一定時間。反應結束后，將反應液冷卻至室溫，然后加入5 g水，攪拌均勻，抽濾除去不溶物，收集濾液。氨基酸種類及用量、反應時間等條件見表1。

表1 煙草水提物的Maillard反應條件Tab.1 Maillard reaction conditions for aqueous extracts of tobacco

1.2.3 還原糖、總糖質量分數的測定

借鑒YC/T 159—2002［16］的方法測定樣品中還原糖和總糖的質量分數。稱取0.20 g樣品，加入30 mL萃取劑，室溫振蕩15 min，經尼龍66 濾膜過濾后進樣分析。

1.2.4 Maillard反應產物成分分析

定性及定量分析：分別稱量0.50 g 樣品，加入5 mL 含內標（10.296 μg/mL 丙酸蘇合香酯）的二氯甲烷萃取劑，室溫振蕩50 min，將萃取液干燥、過濾后進行GC-MS分析。每個樣品測定2次，取平均值。

加標回收率：分別稱量0.50 g 樣品，加入5 mL含內標（10.296 μg/mL丙酸蘇合香酯）的二氯甲烷萃取劑及一定量的混標溶液，使待測物濃度分別為樣品中濃度的0.5、1.0 和2.0 倍，室溫振蕩3 h，將萃取液干燥、過濾后進行GC-MS分析。每個樣品測定2次，取平均值。

GC-MS分析條件：

色譜柱：DB-WAXetr毛細管柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；進樣口溫度：250 ℃；載氣：高純氦氣，流速1.0 mL/min；進樣量：1 μL；分流比：10∶1；程序升溫電離方式：EI；離子源溫度：230 ℃；電子能量：70 eV；四極桿溫度：150 ℃；電子倍增器電壓：1.89 kV；質量掃描范圍：33～500 amu；掃描方式：選擇離子掃描，根據保留時間劃分時間段。待測物保留時間（Retention time，RT）、定性及定量離子的參數選擇見表2。

表2 待測化合物和內標的保留時間和選擇離子Tab.2 Retention time and selected ions for the analytes and internal standard

1.2.5 感官評價

參考《煙用香料在卷煙中作用評價方法》［17］和《中式卷煙風格感官評價方法》［18］進行感官評價，以感知標示量值標度法進行賦值［19］。挑選質量為（0.815±0.02）g、吸阻為（1 100±100）Pa 的“七匹狼”空白卷煙樣品，將0#～11#Maillard反應產物分別稀釋至質量分數為10%（溶劑為水），用自動加香注射機注射于空白卷煙中，注射量1 μL/支，開始和結束注射點距煙絲端分別為5和55 mm。注射完畢后，將卷煙裝入煙盒中，密封于溫度（22±2）℃、相對濕度（60±5）%條件下平衡1 周。由7 位已取得卷煙感官評吸資格證書的專業人員分別從香氣和豐濃等品質特征，酸味、甜味和苦味等味覺特征，以及干草香、木香、辛香和焦香等風格特征等方面對加香效果進行評價。

1.2.6 相關分析

采用SPSS 18.0軟件對Maillard反應產物和卷煙感官指標進行簡單相關分析，P＜0.05 為顯著相關，P＜0.01為極顯著相關。

2 結果與討論

2.1 Maillard反應產物定量分析方法學驗證

對2#反應產物進行定性分析，從中共篩選出21種Maillard反應產物，其中能購得標準品的共17種；2-羥基-3-戊酮、2-呋喃基羥基甲基酮、6-乙基-5，6-二氫-2H-吡喃-2-酮和2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮無標準品，因而這4種成分采用內標峰面積比進行定量。待測物的線性方程、相關系數、檢測限、定量限、RSD和加標回收率見表3。相關系數范圍為0.995 6～0.999 9，檢測限和定量限分別為9.39～1 436.45 和31.30～4 788.17 μg/kg，RSD 為0.75%～9.81%，加標回收率為90.00%～111.64%。該方法靈敏度較高，精密度較好，可滿足實驗要求。

表3 待測物的線性方程、相關系數、檢測限、定量限、RSD和加標回收率（n=10）Tab.3 Linear equations， correlation coefficients， limits of detection， limits of quantification， RSDs and spiked recoveries of the analytes（n=10）

2.2 氨基酸種類對Maillard反應產物的影響

由于煙草水提物中含有大量的還原糖，以及少量的含氮化合物，其自身也可發生Maillard 反應，因而以煙草水提物自身的Maillard 反應為空白樣品（0#），對比添加氨基酸后反應產物質量分數的變化。21 種香味成分中，N-甲基-2-吡咯甲醛、4-環戊烯-1，3-二酮和5-乙酰氧基甲基-2-糠醛的質量分數不隨反應條件的改變而發生變化，表明這3種成分與Maillard 反應過程無關，而是水提物自身的香味成分，因而后續不再詳細探討。

水提物自身的Maillard反應產物中18種待測物的總質量分數為1 319.85 μg/g，其中5-羥甲基糠醛的質量分數最高，占總量的70.50%；其次為羥基丙酮、糠醇、2-乙酰基吡咯；質量分數最低的為2-羥基-3-戊酮和2-呋喃基羥基甲基酮。由于水提物中含N化合物的質量分數較低，因而Maillard反應程度較弱，其還原糖質量分數僅從147.41 mg/g 降低至138.68 mg/g（圖1）。

圖1 不同反應條件Maillard反應產物中還原糖和總糖的質量分數（圖1b中氨基酸為谷氨酸）Fig.1 Mass fractions of reducing sugars and total sugars in Maillard reaction products under different reaction conditions（the amino acid in Fig.1b is glutamic acid）

還原糖與氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸）以1∶1的摩爾比進行反應，考察氨基酸種類對反應產物的影響，結果見表4。可知，當氨基酸為谷氨酸或天冬氨酸時，反應產物中香味成分總量均較0#空白樣品明顯提高，而脯氨酸卻有降低的趨勢，主要是由5-羥甲基糠醛的質量分數降低引起的。Maillard 反應體系中5-羥甲基糠醛的凈含量是其生成和降解共同作用的結果，氨基酸與葡萄糖經過一系列反應產生脫氧葡萄糖醛酮，進而轉化為5-羥甲基糠醛，隨反應程度的加深，5-羥甲基糠醛又可與殘余的氨基酸反應，從而降低其質量分數［20-21］。以谷氨酸或天冬氨酸為氮源時，反應產物均以5-羥甲基糠醛為主，其次為羥基丙酮、2-乙酰基吡咯，質量分數最低的為2-羥基-3-戊酮和2-呋喃基羥基甲基酮，這一特征與0#樣品相似。不同之處在于，部分物質的質量分數差異較大，例如2-羥基-3-戊酮在谷氨酸體系（1#）中僅為0.25 μg/g，而當氨基酸為天冬氨酸（2#）時，質量分數為1#的14.88倍；2#中糠醇、2-乙酰基吡咯的質量分數均明顯高于1#。以脯氨酸為氮源時，反應產物以羥基丙酮、糠醇和5-羥甲基糠醛為主，其次為3-甲基-1，2-環戊二酮、2-乙酰基吡咯、4-羥基-2，5-二甲基-3（2H）-呋喃酮和2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮。其中，糠醇的質量分數較天冬氨酸和谷氨酸反應體系明顯提升，分別是1#和2#的54.77 和 13.82 倍，3-甲基-1，2-環戊二酮是 1#的 5.48倍，2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮的質量分數從 10.53 μg/g（2#）增加至 60.33 μg/g（3#）。然而，2，5-二甲酰基呋喃在3#中未檢出。從反應程度上看，3種反應產物中還原糖的質量分數均顯著降低，反應程度從高到低依次為2#、1#和3#。這一實驗結果表明，在相同的反應條件下，氨基酸不同時，反應程度稍有不同，但反應產物的組成及質量分數差異較大。當氨基酸為天冬氨酸和谷氨酸時，反應產物的組成與煙草水提物自身的Maillard 反應產物相似，但質量分數有所提高；當氨基酸為脯氨酸時，反應產物的組成與其他兩者差異較大。

表4 不同氨基酸種類Maillard反應產物的定量分析結果Tab.4 Quantitative analysis results of Maillard reaction products of different amino acids

通過感官作用評價，考察不同種類氨基酸Maillard 反應產物的感官作用差異（表5）。結果表明，當氨基酸為谷氨酸（1#）時，煙氣香氣質、香氣量均較空白（0#）明顯改善，煙氣濃度增強，口腔刺激性降低，煙氣細膩柔和，烘焙香和甜香明顯增強；當氨基酸為天冬氨酸（2#）時，對煙氣香氣量的改善最明顯，但煙氣細膩程度和透發性略低于1#，烘焙香高于1#，而甜香降低；當氨基酸為脯氨酸（3#）時，烘焙香濃郁，但煙氣狀態較散，特點不突出。綜合考慮，1#對香氣質、香氣量均有明顯改善，且煙氣細膩柔和，刺激性小，甜香明顯。因而，在后續研究中以谷氨酸為研究對象。

表5 Maillard反應產物在參比卷煙上的感官評價結果（得分）①Tab.5 Scores of sensory evaluation of Maillard reaction products in reference cigarette

2.3 氨基酸用量對Maillard反應產物的影響

隨谷氨酸用量的增加，反應程度逐漸增強，待測物總量呈先增加后降低的趨勢（表6）。當還原糖（以葡萄糖計）與谷氨酸的摩爾比（n還原糖∶n谷氨酸）為1∶0.5時，待測物的總量最高；當摩爾比增加至1∶2 時，待測物的總量顯著降低，這可能與反應過程中大分子類黑精的生成有關。從成分上看，5-羥甲基糠醛在1∶0.5 的條件下質量分數最高，氨基酸用量的增加反而使其質量分數下降。與此類似的還有2-乙酰基吡咯、糠醛、羥基丙酮等。4-羥基-2，5-二甲基-3（2H）-呋喃酮略低于0#，且幾乎不隨谷氨酸用量的變化而改變（20.72～22.76 μg/g）。由表4 可見，該成分主要是由脯氨酸的存在引起的，因而當氨基酸為谷氨酸時，不額外產生該物質。這一結果與文獻［11］的報道相吻合。2-乙酰基呋喃隨谷氨酸用量的增加而增加，最高質量分數為30.79 μg/g，最低為5.99 μg/g。當氨基酸用量最低時，2，5-二甲酰基呋喃的質量分數最高（41.75 μg/g），隨氨基酸用量的增加逐漸降低至6.35 μg/g。由此可見，通過調控氨基酸用量，可以改變Maillard反應產物中各成分的質量分數，進而影響其在卷煙中的感官作用。

表6 不同還原糖與谷氨酸摩爾比Maillard反應產物的定量分析結果Tab.6 Quantitative analysis results of Maillard reaction products at different mole ratios of reduced sugar to glutamic acid

感官評價結果表明，當谷氨酸的用量較低時，卷煙品質特征改善程度較弱，口腔殘留和刺激性明顯；用量過高則會導致香氣質和香氣量下降，刺激殘留明顯，烘焙香和甜香均降低。當還原糖與谷氨酸的摩爾比為1∶1或1∶0.5時，香氣質、香氣量均有明顯改善，煙氣濃度增加，透發性變好，烘焙香和甜香均明顯增強。綜合考慮，最佳反應摩爾比選取1∶0.5。

2.4 反應時間對Maillard反應產物的影響

隨反應時間的延長，Maillard反應產物的總量先增加后降低（表7）。當反應時間為2 h 時，質量分數最高。此時還原糖的質量分數為73.93 mg/g，將反應時間延長至3 h 時，反應程度雖有加深，但反應產物的質量分數略降低。從待測物的質量分數來看，大多數化合物隨反應時間的延長，其質量分數先增加后降低，而3-乙酰基吡啶的質量分數隨反應時間的延長而下降。由表4 可知，3-乙酰基吡啶與脯氨酸的相關性強，因而其質量分數的降低可能與煙草水提物中少量的脯氨酸無法與還原糖發生反應有關。

表7 不同反應時間Maillard反應產物定量分析結果Tab.7 Quantitative analysis results of Maillard reaction products with different reaction time

感官評價結果表明，反應時間過長煙氣雜氣增加，口腔刺激和殘留程度加深，香氣質、香氣量改善程度較弱，透發性有改善，甜香和烘焙香有不同程度增強。當反應時間為2 h 時，香氣質較0#略有改善，香氣量顯著增強，煙氣濃度和透發性改善明顯，雜氣降低；在風格特征方面，烘焙香和甜香顯著增強。綜合考慮品質特征和風格特征的改善情況，最佳反應時間選擇2 h。

2.5 Maillard反應產物與反應條件的依賴性關系

將極差與平均值之比作為極差系數，對Maillard反應產物中的18種化合物與反應條件的依賴關系進行探討，結果見表8。極差/平均值的數值越大，說明數據的離散度越高，即該化合物隨該反應條件的變化，其質量分數變化較大；反之亦然。與氨基酸用量依賴性較強的化合物有2-乙酰基呋喃、糠醇、2，5-二甲酰基呋喃、2-呋喃基羥基甲基酮和5-羥甲基糠醛；與反應時間依賴性較強的化合物為2-甲基四氫呋喃-3-酮、5-甲基糠醛、3-乙酰基吡啶、2-呋喃基羥基甲基酮和2，3-二氫-3，5-二羥基-6-甲基-4（H）-吡喃-4-酮；其中2-呋喃基羥基甲基酮受氨基酸用量和反應時間的影響均較大。這一結果可為Maillard反應產物的可控制備提供依據。

表8 待測物與反應條件的依賴性關系Tab.8 Dependence of target analytes on reaction conditions

表8（續）

2.6 Maillard 反應產物與卷煙感官指標的相關性分析

采用簡單相關分析方法對Maillard 反應產物與卷煙感官指標之間的相關性關系進行研究，結果見表9。與濃度相關關系密切的是2-甲基四氫呋喃-3-酮；與透發性關系密切的化合物有糠醛、5-甲基糠醛、2-呋喃基羥基甲基酮和5-羥甲基糠醛，其中5-甲基糠醛為極顯著相關關系；與烘焙香相關關系密切的化合物為羥基丙酮和3-甲基-1，2-環戊二酮；6-乙基-5，6-二氫-2H-吡喃-2-酮與柔和呈顯著負相關關系。18種待測物與其他感官指標（香氣質、香氣量、雜氣、細膩、刺激、殘留、清香、膏香和甜香）不存在顯著相關性。

表9 Maillard反應產物與卷煙感官指標的相關性關系①Tab.9 Correlations between Maillard reaction products and cigarette sensory indexes

3 結論

①氨基酸種類直接影響Maillard 反應產物中致香成分的組成，當氨基酸為谷氨酸或天冬氨酸時，反應產物中的致香成分以5-羥甲基糠醛為主，其次為羥基丙酮、2-乙酰基吡咯；當氨基酸為脯氨酸時，反應產物中的致香成分以羥基丙酮、糠醇和5-羥甲基糠醛為主。②以感官作用結果為依據，基于煙草水提物的Maillard反應最佳反應條件：還原糖與谷氨酸的摩爾比（n還原糖∶n谷氨酸）=1∶0.5、反應溫度110 ℃、反應時間2 h。③Maillard反應產物與卷煙感官作用相關性結果表明，與煙氣濃度相關關系密切的化合物為2-甲基四氫呋喃-3-酮，與透發性關系密切的化合物有糠醛、5-甲基糠醛、2-呋喃基羥基甲基酮和5-羥甲基糠醛，與烘焙香相關關系密切的化合物為羥基丙酮和3-甲基-1，2-環戊二酮。在制備Maillard 反應產物時，適當提高上述化合物的質量分數，有利于卷煙感官質量的提升。