TOMM40在結直腸癌組織中的表達及意義

嵇如月，于 新，趙晨蕊，何成彥，方 玲

(吉林大學中日聯誼醫院 檢驗科，吉林 長春130033)

結直腸癌是世界第三大最常見癌癥[1]。其發病率和死亡率在全球范圍內不斷增加，僅2020年全球結直腸癌新發病例為193.16萬，死亡病例93.52萬,因此迫切需要降低發病率和死亡率[2]。本實驗通過二維色譜質譜聯用技術(LC-MS)及免疫印跡探究TOMM40在結直腸癌組織及癌旁組織的表達及意義，為結直腸癌的篩查和診斷提供一個新的方向。

1 材料與方法

1.1 一般資料

本研究所選用的結直腸癌及配對癌旁組織標本經病理醫師確認均為DukesB期腺癌，共16對，來源于胃腸外科手術切除，標本采集時間段為2018年1月到2020年12月，所有患者均簽署了知情同意書，且保證術前沒有經過任何方式治療。組織獲取后用事先預冷的PBS沖洗干凈，去除壞死組織及血液，迅速進行液氮速凍，然后放在-80℃冰箱保存，以備后續實驗使用。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀，TPCK修飾的測序級胰酶，NH4HNO3，DTT，LTQXL 離子阱質譜儀、反向毛細管色譜分析柱，TOMM40單抗，GAPDH多抗，PMSF，BCA蛋白質定量試劑盒，碘代乙酰胺，DNA酶，RNA酶。

1.3 方法

1.3.1樣品總蛋白的提取及測定 將組織樣本從-80℃冰箱取出，充分研磨后加入裂解液冰上裂解30 min。加入適量DNA酶和RNA酶去除組織中殘留DNA和RNA，12 000 rpm(4℃)離心10 min，即得到總蛋白。蛋白濃度測定用BCA蛋白定量試劑盒，按說明書要求，將96孔板加好，測定其在562 nm處的吸光度，根據所得數據繪制蛋白質濃度標準曲線。

1.3.2蛋白質多肽混合物的制備 室溫下自然融化樣品，把各樣品終濃度調至20 mmol/L，此過程可用適當體積及濃度的NH4HNO3和DTT幫助稀釋，56℃，避光，充分反應1 h。冷卻至25℃左右后后再調整終濃度為50 mmol/L,此過程需補充一定量的1 mol/L的IAM，避光，充分反應半小時。加入適量胰酶，保證蛋白和胰酶的比例為50∶1，在37℃水浴箱中培養過夜，把得到的蛋白質多肽混合物分裝并保存在-80℃冰箱里，以備后續實驗使用。

1.3.3二維色譜質譜聯用技術分析 將得到的蛋白多肽混合物用0.1%的FA溶解，每組樣品分別取50 μg用于上樣，通過強離子交換柱和反向柱洗脫分離蛋白多肽樣品，用LTQXL離子阱質譜儀分析，獲取LC-MS圖譜。

1.3.4免疫印跡試驗 用免疫印跡實驗對結直腸癌組織的TOMM40蛋白表達量進行檢驗，驗證LC-MS的分析結果。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 二維色譜與質譜聯用技術分析結果

本實驗癌組織及癌旁組織中同一蛋白的豐度通過圖譜數來衡量，差異蛋白的滿足條件為兩個樣品中蛋白圖譜數比值 ≥1且蛋白圖譜數差值 ≥72 。基于以上標準，本研究檢測到Ca199、Ca153、FGB、POSTN、MUC2等21個上調蛋白，MYL9、CNN1、CKB、HSPB1、FLNA等11個下調蛋白。TOMM40為其中一個上調蛋白，質譜圖結果見圖1。

2.2 免疫印跡試驗結果

對16對組織的TOMM40表達量檢測后結果如圖2所示。TOMM40在癌組織中的表達量明顯增高(P<0.05)。

3 討論

近年來，結直腸癌因早期診斷率低和治療效果差已成為人們關注的問題[3]。其發病率在全球范圍內急劇上升，尤其在50歲以下的人群中，因此需要新的診斷和治療選擇[4]。

圖1 TOMM40 質譜圖結果

圖2 TOMM40 免疫印跡結果

線粒體是必不可少的細胞器，通過調節細胞和組織之間的通信來影響生物體的生理功能，因此線粒體功能障礙已成為包括衰老、癌癥和代謝紊亂等疾病的關鍵影響因素[5]。線粒體由兩個獨立的膜組成：外膜包圍可溶性膜間隙，內膜包圍蛋白質密集的基質空間[6]。TOMM40又叫線粒體外膜轉位酶40，對于蛋白質進入線粒體至關重要，與TOM20、TOM22共同組成線粒體外膜蛋白Tom復合體[7]。TOMM40位于TOM復合體的中心，通道由TOM40的β-桶狀核心組成，并由其他亞基起穩定作用[8]。TOMM40復合體核心的直徑至少能容得下兩個多肽的環狀結構。在動物和真菌中，TOMM40復合體的起始受體亞基包括TOM20和TOM70，TOM20在N端具有一個跨膜組分定位于外膜，C端受體區域朝向胞質溶膠一側。Gottschalk等人發現TOMM40與遲發型阿爾茨海默病的風險和發病年齡相關，并且是迄今為止遺傳研究中確定的唯一可能導致遲發型阿爾茨海默病相關線粒體功能障礙的核編碼基因[9]。也有文獻研究表明TOMM40與癌細胞中的線粒體密切相關，并調節ATP的產生和癌細胞的生長[10-11]。Yang研究發現TOMM40在卵巢癌細胞中的表達高于正常卵巢上皮細胞，TOMM40基因敲除降低了卵巢癌細胞系的增殖，并降低了腫瘤負擔，且高表達TOMM40的上皮性卵巢癌患者的預后比低表達TOMM40的患者更差[12]。鄭永昌[13]通過免疫印跡、RT-PCR、免疫組化實驗表明，TOMM40在胰腺癌組織及細胞中都有高表達趨勢，TOMM40是胰腺癌新的候選免疫原性膜抗原，有望用于胰腺癌的早期診斷。

本實驗通過LC-MS和免疫印跡兩種技術對結直腸癌及癌旁組織進行了分析和驗證，確定TOMM40在結直腸癌組織中高表達，這對解決當前結直腸癌篩查和診斷的局限性提供了一個新的潛在策略，但TOMM40在結直腸癌里升高的機制還不清楚，需要下一步實驗探究發掘。