食管胃交接部腺癌患者T細胞表達與病理參數及淋巴結轉移的關系研究

李東輝,李 杰,王艷偉

(邯鄲市第一醫院紡醫院區 綜合外科，河北 邯鄲056004)

食管胃交接部腺癌(AEG)位于食管、胃的移行區，兼有食管癌與胃癌的特征，該部位的腺癌可侵入賁門，并由賁門癌向上侵入食管下段，導致交接部癌、食管腺癌、賁門腺癌的重疊性發生，病情復雜、腫瘤分類錯綜[1-2]。AEG發病因素眾多，目前比較明確的有肥胖、Barrett食管、胃食管反流，手術治療是本病的主要治療手段，其中根治切除(在保證安全的基礎上完全切除原發腫瘤及徹底清掃可能轉移的區域淋巴結)是目前最有效的方式，然而AEG特殊的生物學行為使得單純手術治療的5年生存率僅為10%-38.7%之間，70%的患者發生了胸膜、肝臟、腹膜的轉移[3-6]。有研究顯示，AEG在早期發生淋巴結轉移則5年生存率一般低于30%，若在進展期發生淋巴結轉移則5年生存期<15%[7-8]。20世紀末，有實驗發現人體內存在由腫瘤引發的T淋巴細胞亞群抑制抗腫瘤免疫反應，且隨著調節性T細胞(Treg)被認識，免疫系統在監控腫瘤發生發展中的意義日漸顯著[9-10]。腫瘤發生時，人體免疫耐受、抑制抗腫瘤免疫效應等被激活，繼而發生免疫抑制現象。本研究采用免疫組化分析法對AEG患者的T細胞進行觀察，探討免疫系統與AEG發生發展間的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2013年1月至2016年6月邯鄲市第一醫院紡醫院區收治的AEG患者120例為研究對象。其中，男性90例，女性30例；年齡40-74歲，平均(60.57±8.47)歲；腫瘤最大直徑1.0-20.0 cm，平均(6.04±0.07) cm；根據國際抗癌聯盟/美國癌癥聯合委員會的TNM分期標準，Ⅰ-Ⅱ期患者85例，Ш期患者35例；組織學分化中高分化者62例，低分化者58例。根據標本采集部位對患者進行分組，AEG組取食管胃交接部腺癌標本，共70例；對照組取腫瘤組織旁2-3 cm范圍內的正常組織，共50例。納入標準：根據《食管胃結合部腺癌外科治療中國專家共識》[11]關于AEG的診斷標準,以及超聲內鏡、病理學確診；患者術前均未進行過放化療和其他抗癌治療。排除標準：既往進行過手術、放化療而復發的AEG患者，預估生存期<3個月的AEG患者，合并有其他惡性腫瘤者，具有嚴重心腦血管、肝腎功能衰竭者。所有入選者及其家屬均對本研究內容知情、了解，并簽署知情同意書；本次研究經醫院醫學倫理委員會批準開展。

1.2 方法

1.2.1免疫組化法步驟 對手術中采集的標本進行多聚甲醛固定、石蠟包埋，并連續切片，HE染色核實病理診斷。采用免疫組化SP法對CD8、Foxp3進行染色，具體步驟為：組織切片，70°溫箱中烤片3-12 h，脫蠟、水沖洗3 min，切片置于濕片盒中PBS沖洗，高溫水浴法抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，切片置于濕盒中PBS沖洗，滴加一抗，濕盒放置常溫下15 min，PBS沖洗，滴加二抗，PBS沖洗，顯色，25℃下蘇木素染色5 min，75%乙醇0.5 min 1次、95%乙醇0.5 min 1次、100%乙醇0.5 min 1次、二甲苯3 min 2次后樹脂封片。

1.2.2結果判定 400高倍鏡下對每張切片隨機選擇6個視野腫瘤細胞進行觀察，采用半定量計分法進行判定，0分為陽性細胞比例≤5%、1分為陽性細胞比例>5%且≤25%、2分為陽性細胞比例>25%且≤50%、3分為陽性細胞比例>50%且≤75%、4分為陽性細胞比例>75%。陽性細胞判定：細胞質出現棕褐色、黃色顆粒為CD8陽性，細胞核出現黃褐色或黃色顆粒為Foxp3陽性。實驗中由兩位病理科醫師采用雙盲法進行讀片。

1.3 統計學方法

采用SPSS18.0統計學軟件對收集到的數據進行分析，計數資料采用卡方檢驗，計量資料采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AEG組與對照組中CD8+與Foxp3的表達比較

從表1可以看出，AEG組的CD8+陽性率為58.57%(41/70)、Foxp3的陽性率為74.29%(52/70)，對照組的CD8+陽性率為4.00%(2/50)、Foxp3的陽性率為14.00%(7/50)。組間比較，AEG組的CD8+與Foxp3陽性率均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

在腫瘤組織中CD8+與Foxp3均呈陽性表達的患者進行統計。AEG組中同時陽性表達的為29例，陽性率為41.43%；同時呈陰性表達的為2例，陰性率為2.86%。Foxp3為陽性表達、CD8+為陰性表達的為25例，CD8+為陽性表達、Foxp3為陰性表達的為14例。

表1 AEG組與對照組CD8+與Foxp3的表達

2.2 AEG組患者CD8+及Foxp3表達與臨床病理關系

在AEG組中TNM分期的Ⅰ-Ⅱ期患者共40例，Ⅲ期患者30例；組織學分化中高分化者33例，低分化者37例；發生淋巴結轉移共43例，未發生淋巴結轉移者27例。

CD8+在TNM分期中Ⅰ-Ⅱ期的陽性率為50%(20/40)、Ⅲ期為76.67%(23/30)；Ⅰ-Ⅱ期與Ⅲ期比較差異顯著(χ2=5.145，P<0.05)。CD8+在中高分化組織中的陽性率為42.42%(14/33)、低分化的陽性率為59.46%(22/37)；中高分化與低分化比較差異不顯著(χ2=2.026，P>0.05)。CD8+在發生淋巴結轉移組的陽性率為55.81%(24/43)，未發生淋巴結轉移組的陽性率為29.63%,兩組比較，差異有統計學意義(χ2=4.214，P<0.05)。

Foxp3在TNM分期中Ⅰ-Ⅱ期的陽性率為55%(22/40)、Ⅲ期為90%(27/30)，Ⅰ-Ⅱ期與Ⅲ期比較差異顯著(χ2=10.000，P<0.05)。Foxp3在中高分化組織中的陽性率為51.52%(17/33)、低分化的陽性率為70.27%(26/37)，中高分化與低分化比較差異不顯著(χ2=2.590，P>0.05)。Foxp3在發生淋巴結轉移組的陽性率為76.74%(33/43)，未發生淋巴結轉移組的陽性率為37.04%，兩組比較，差異有統計學意義(χ2=24.605，P<0.05)。見表2。

表2 CD8+與Foxp3在AEG組表達與臨床病理的關系

2.3 AEG組患者CD8+與Foxp3表達與5年生存率關系

本研究中AEG組患者經腹入路行根治性切除術，5年及以上生存者17例，5年以下生存者為53例。生存期<5年的CD8+表達陽性率為37.74%(20/53)，≥5年的CD8+表達陽性率為41.18%(7/17)；生存期<5年與≥5年的CD8+表達陽性率比較差異不顯著(χ2=0.064，P>0.05)。生存期<5年的Foxp3表達陽性率為69.81%(37/53)，≥5年的Foxp3表達陽性率為23.53%(4/17)；生存期<5年與≥5年的Foxp3表達陽性率比較差異顯著(χ2=11.362，P<0.05)。見表3。

表3 CD8+與Foxp3表達與AEG組患者5年生存率關系

3 討論

免疫耐受、免疫逃逸在腫瘤發展過程中發揮著重要作用，其相關作用機制的研究已十分廣泛。Treg是一群同時具有免疫抑制和免疫低反應的T細胞亞群，在維持外周免疫耐受、預防自身免疫性疾病、阻斷移植排斥反應中均發揮著重要作用。Treg對T細胞應答具有較強的抑制作用，在抵抗機體抗腫瘤免疫中具有重要作用，是腫瘤免疫逃逸的重要因素。有研究認為，Treg通過穿孔素-顆粒媒介的細胞毒作用、細胞表面表達細胞毒性T淋巴細胞相關抗原、轉化生長因子-β、白介素分泌等途徑實現免疫抑制[12-14]。抗原Foxp3是Treg的特異性標志物，有研究顯示Treg彌散分布在CD8+T細胞區域[15]，故在本次研究中選擇CD8+、Foxp3作為AEG患者的主要觀察指標，探討T細胞表達與本病病理特點、預后的關系。

從本次研究結果來看，CD8+與Foxp3在AEG腫瘤組織中的陽性率均明顯高于癌旁的正常組織，其中Foxp3表達陽性較高，且在對CD8+與Foxp3兩項同時觀察時，兩者同時為陰性的占比僅為2.86%，說明CD8+與Foxp3在特定區域腺癌中具有高表達特征，尤以Foxp3陽性表達為顯著。有學者在對肝癌小鼠進行觀察時發現，腫瘤引流淋巴結內CD8+T細胞在體外刺激分泌IFN-γ的功能可恢復，由于Treg常彌散在CD8+T細胞區域，因此推測腫瘤組織中Treg通過抑制CD8+T細胞來促進腫瘤發展[16-17]。從病理關系來看，CD8+與Foxp3均在TNM分期中Ⅲ期陽性表達性較高，說明二者在辨別AEG分期、組織學中具有重要意義。

胃與食管結合部解剖部位特殊、淋巴引流復雜，有統計顯示AEG的淋巴結轉移率高達57%-79%[18]；張彥軍[19]在對393例AEG患者進行病理學特征觀察時發現，275例患者發生了淋巴結轉移，轉移率為70%。淋巴結轉移是影響腫瘤患者預后的重要影響因素，對AEG患者淋巴轉移規律的研究十分重要。在本次研究中，淋巴結轉移患者的CD8+、Foxp3陽性率均高于未發生淋巴結轉移的患者，且在淋巴結轉移患者中Foxp3陽性率最高。在對患者進行5年生存期觀察時發現，AEG患者生存期<5年的Foxp3陽性率較高，說明該指標對預測AEG患者預后具有一定參考性。相關研究顯示，肺癌患者的Foxp3表達參與了抑制腫瘤特異性T細胞增殖的過程，在胃腸道惡性腫瘤晚期患者血液中Treg含量明顯高于早期患者，這些結果與本研究共同說明Treg在推動腫瘤發展中具有重要作用，是影響腫瘤患者預后的重要因素。

綜上所述，AEG腫瘤組織中CD8+與Foxp3均有較高的陽性率，且以Foxp3表達最為明顯，二者對于判斷AEG患者預后具有一定價值。在接下來的研究中，擬對多中心AEG患者的腫瘤病理表現與T細胞關系進行觀察，進一步探討AEG發展特點與機制，為臨床治療提供更具針對性的理論依據。