中國西北地區漢族苯丙酮尿癥患者苯丙氨酸羥化酶基因突變分析

何 江，強 榮，毛新梅，王慧珍，閆有圣，鄒紅云，史清海*

(1.新疆軍區總醫院 檢驗科，新疆 烏魯木齊830000；2.陜西省婦幼保健院 醫學遺傳中心，陜西 西安710003；3.寧夏回族自治區婦幼保健院 新生兒疾病篩查中心，寧夏 銀川750011；4.青海省婦幼保健院 新生兒疾病篩查中心,青海 西寧810000；5.甘肅省婦幼保健院 醫學遺傳中心，甘肅 蘭州730050)

苯丙酮尿癥(PKU)是一種常染色體隱性遺傳病，屬于苯丙氨酸羥化酶(PAH)缺乏癥之一，是PAH基因突變導致酶活性降低或喪失，苯丙氨酸(Phe)在體內無法正常代謝而異常蓄積及其旁路代謝產生的有害性代謝物質引起患者嚴重智力低下及神經行為異常[1]。目前，在PAH基因的13個外顯子(exon，E)以及內含子(intron，I)、5′非翻譯區(5′-UTR)和3′非翻譯區(3′-UTR)等區域發現有錯義突變、小缺失、剪切位點突變、沉默突變、無義突變、小插入及大片段插入等致病突變形式[2-3]。截至2020年7月22日，世界范圍內報道的PAH基因突變已達1188種(http://biopku.org/pah/search-results-browse.asp)，不同國家和民族的PAH基因種類和頻率差異明顯，這為全面闡述各地區及種族PKU發病的分子機制奠定了遺傳基礎。本研究對西北地區確診的223例漢族PKU患兒進行PAH基因突變分析，旨在探究西北地區漢族PKU患者PAH基因的突變規律及分布特點，歸納總結出西北地區漢族PKU患者的PAH基因突變譜，對于指導本地區產前診斷、攜帶者篩查及了解PAH基因的進化、漂移非常重要，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 資料來源選取2003年1月-2019年8月經西北五省區新生兒疾病篩查中心或醫學遺傳中心篩查繼而確診的223例漢族PKU患者，包括新疆71例，陜西55例，青海32例，寧夏35例，甘肅30例。其中，男114例，女109例，年齡范圍從2個月至15歲，平均年齡(3.3±0.7)歲。初診血清Phe濃度為226-2430 μmol/L。確診標準：對出生72小時后充分哺乳新生兒采集足跟血，對門診患兒采集靜脈血，測定Phe濃度>120 μmol/L者進行召回復查，復查Phe濃度仍然>120 μmol/L，首先確診為高苯丙氨酸血癥(HPA)，再采集患兒血樣及尿液標本進行血二氫蝶呤還原酶測定、四氫生物蝶呤(BH4)負荷試驗(>600 μmol/L)或者Phe和BH4聯合負荷試驗(≤600 μmol/L)及尿蝶呤譜分析，排除四氫生物蝶呤缺乏癥、一過性高苯丙氨酸血癥和酪氨酸血癥等。對Phe>600 μmol/L患兒行低苯丙氨酸飲食控制治療。所有受試者均簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會批準實施。

1.2 檢測方法標本采集及DNA提取：抽取患兒及父母外周靜脈血1 ml，滴于濾紙上呈3-5個濾紙斑，陰涼干燥避光處晾干，1-2 h后裝入無菌干凈密封袋內備用。采用血片快速酚/氯仿抽提法，提取基因組DNA保存于-20℃備用；PCR擴增及序列測定：PAH基因啟動子及第1-13外顯子的引物序列參照文獻[4]，嚴格按照引物序列設計原則設計完成。PCR擴增參數及具體操作步驟參照文獻[5]。采用PCR產物直接測序法，樣品純化及序列分析應用美國ABI 3130 XL型序列分析儀完成。每個測序樣品進行兩次PCR，分別測定正、反方向的基因序列，所有序列變異位點均針對該位點，檢測患者父母的DNA序列，以確定序列變異來源。如有新突變同時對患者雙親進行序列分析。

1.3 突變命名和驗證已知突變的命名結合測序結果參照http://pahab.mcgill.ca提供的突變名稱命名。新突變的命名參照http://www.hgvs.org /mutnomen提供的命名法來命名。新序列變異通過查閱國際PAH數據庫(http://www.biopku.org/pah)、國際人類基因突變數據庫專業版Pubmed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Pubmed)來確定，所有新變異均通過100名健康無關個體相應外顯子測序排除為多態性位點后被認定為新突變。

1.4 統計學分析用SPSS 15.0軟件進行數據統計和分析，計數資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 西北地區漢族PKU患者PAH基因突變分布及特點

西北地區漢族PKU患者PAH基因致病突變檢出率為88.6%(395/446)，在446條等位基因中共檢測出75種PAH基因致病突變，來自外顯子的有66種(88.0%)，來自內含子的有9種；共涉及5種突變形式，其中，錯義突變50種(66.7%)、剪切位點突變12種(16.0%)，無義突變7種(9.3%)，移碼突變4種(5.3%)，缺失突變2種(2.7%)。本研究中，除了外顯子1和外顯子13之外，在其他外顯子中均檢測到外顯子突變，還在內含子4、內含子7、內含子8、內含子10、內含子11、內含子12中檢測到46個剪切位點突變(10.3%)，其中PAH基因致病突變主要分布在E7(29.0%)、E6(10.5%)、E3(10.3%)、E11(9.6%)、E12(8.5%)、I4(6.7%)和E2(4.5%)。突變頻率較高的PAH基因致病突變是R243Q(22.1%)、IVS4-1G>A(6.7%)、EX6-96A>G(6.5%)、R111X(5.4%)、R53H(4.3%)、Y356X(4.0%)、R413P(3.8%)、V399V(3.1%)、IVS7+2T>A(1.8%)，這些常見突變約占基因突變的57.7%，其余突變均為散在發生(<2.0%)。

2.2 西北地區漢族PKU患者PAH基因常見致病突變檢出率與其他國家及地區比較

如表1所示，西北漢族PKU患者最常見的PAH基因突變是R243Q，與中國北方基本一致，但明顯區別于日本(R413P)、巴西(V388M)及德國(R408W)、立陶宛(R408W)、美國(R408W)。西北漢族PKU患者PAH基因突變構成與中國北方類似，但顯著區別于日本、德國、美國、巴西、立陶宛等亞洲及歐美國家。

表1 西北地區漢族PKU患者PAH基因常見致病突變檢出率與其它國家及地區的比較

2.3PAH基因新突變發現

經檢索國內外文獻及PAH數據庫，在西北漢族檢測出的N93fsX5(c.279_282delCATC)、G171E(c.512G>A)、P225S(c.673C>T)、Q304K(c.910 C>A)、H107R(c.320 A>G)、F392I(c.1174 T>A)和N223I(c.668A>T)是國際上尚未見報道的新的PAH基因突變，并已提交國際PAH突變基因數據庫(http://www.biopku.org/pah/)登記。N93fsX5突變(圖1)是由于在PAH基因編碼區279-282核苷酸之間發生了CATC 4個堿基的缺失，導致第93位氨基酸由天冬酰胺(Asn)突變為賴氨酸(Lys)，同時引發由此往后排列編碼的第5位氨基酸的密碼子變為終止密碼，屬于第3外顯子上的移碼突變；G171E突變(圖2)是由于編碼區第512位堿基由G變為A，導致第171位氨基酸由甘氨酸(Gly)變為谷氨酸(Glu)，為第6外顯子上的錯義突變；P225S突變(圖3)是由于PAH基因編碼區第673位堿基(第6外顯子)由C變為T，發生第6外顯子上的錯義突變，導致第225位氨基酸由脯氨酸(Pro)變為絲氨酸(Ser)；Q304K突變(圖4)是由于PAH基因編碼區第910位堿基由C變為A，導致第304位氨基酸由谷氨酰胺(Gln)變為賴氨酸(Lys)，為第8外顯子上的錯義突變；H107R突變(圖5)由于PAH基因編碼區第320位堿基由A變為G，導致第107位氨基酸由組氨酸(His)變為精氨酸(Arg)，為第3外顯子上的錯義突變；F392I突變(圖6)是由于PAH基因編碼區第1174位堿基由T變為A，導致第392位氨基酸由苯丙氨酸(Phe)變為異亮氨酸(Ile)，為第11外顯子上的錯義突變；N223I突變(圖7)是由于PAH基因編碼區第668位堿基由A變為T，導致第223位氨基酸由天冬酰胺(Asn)變為異亮氨酸(Ile)，為第6外顯子上的錯義突變。

3 討論

本研究在西北地區漢族PKU患者PAH基因的11個外顯子和6個內含子中共發現75種致病突變，在外顯子中檢出率最高(88.0%)，主要突變形式有5種，但主要以錯義突變、剪切位點突變和無義突變為主(占比92.0%)。無論是突變種類數還是突變形式均顯著區別于伊朗[12]、意大利[13]、西班牙[14]、巴西[11]、美國[10]等其他亞洲、歐洲和美洲國家。這充分表明PAH基因中任何堿基的突變都可能導致酶活性的降低或缺失，導致PKU發生，表現出突變遺傳異質性的復雜多樣性[15-16]。研究發現西北地區漢族PAH基因致病突變主要分布在E7(29.0%)、E6(10.5%)、E3(10.3%)、E11(9.6%)、E12(8.5%)、I4(6.7%)和E2(4.5%)，這與歐洲人更多集中在第3、10和12外顯子明顯不同[9]，提示進行PKU早期篩查和基因診斷時應首先選擇這些PAH基因突變熱點外顯子和內含子區域。西北地區漢族PKU患者中居于首位的PAH基因突變為R243Q(22.1%)，與中國北方[6]、韓國[8]基本一致，但明顯區別于日本[7]、巴西[11]最常見突變分別為R413P、V388M，也區別于德國[9]、立陶宛[9]、美國[10]等歐美國家最常見的R408W突變。

圖1 PAH基因外顯子3 N93fsX5(c.279_282delCATC，p.Asn93LysfsX5)雜合子突變箭頭所示為基因突變位置

圖2 PAH基因外顯子6 G171E(c.512G>A，p.Gly171Glu)雜合子突變箭頭所示為基因突變位置

圖3 PAH基因外顯子6 P225S(c.673C>T，p.Pro225Ser) 雜合子突變箭頭所示為基因突變位置

圖4 PAH基因外顯子8 Q304K(c.910 C>A,p.Gln304Lys)雜合子突變箭頭所示為基因突變位置

圖5 PAH基因外顯子3 H107R(c.320 A>G,p.His107Arg)雜合子突變箭頭所示為基因突變位置

圖6 PAH基因外顯子11 F392I(c.1174 T>A,p.Phe392Ile)雜合子突變箭頭所示為基因突變位置

圖7 PAH基因外顯子6 N223I(c.668A>T,p.Asn223Ile)雜合子突變箭頭所示為基因突變位置

此外，本研究發現的常見突變還包括EX6-96A>G(6.7%)、IVS4-1G>A(6.7%)、R111X (5.4%)、R53H(4.2%)和Y356X(4.0%)等突變，PAH基因突變分布構成與中國北方、韓國相似，但顯著不同于日本、德國、美國等亞洲及歐美國家，推測R243Q基因突變頻率的高發在中國北方地區，而歐洲地區是R408W突變的起源地，這充分證實不同國家、地區及不同民族間PAH基因的突變特點的獨特性、差異性和復雜性。

本研究經檢索國內外文獻及PAH相關數據庫(http://www.biopku.org/pah等)，還在西北漢族PKU患者中發現了7種新的PAH基因突變。苯丙氨酸羥化酶通常以具有催化活性的四聚體形式存在，其單體由N端調節區(1-142aa)、催化區(143-410aa)及C端的四聚體區(411-452aa)三部分組成，PAH基因突變對苯丙氨酸羥化酶活性的影響依賴于突變的形式和位置[17]。G171E(青海)、N223I(寧夏)、P225S(新疆)、Q304K(寧夏)、F392I(寧夏)這5種突變均為錯義突變，均位于酶單體中α螺旋富集的催化區，由于某一堿基突變導致相應編碼氨基酸改變，影響苯丙氨酸羥化酶分子活性位點的形狀，進而影響基因轉錄、翻譯以及蛋白質的折疊、聚合，導致酶蛋白的活性功能有所降低。H107R(寧夏)突變位于酶單體的N端調節區，為PAH基因第3外顯子上的錯義突變，由于編碼區第320位堿基由A變為G，導致第107位氨基酸由組氨酸(His)變為精氨酸(Arg)，改變了苯丙氨酸羥化酶的結構并影響了酶活性功能的正常表達。N93fsX5(青海)屬于第3外顯子上的移碼突變，是由于在PAH基因編碼區279-282位核苷酸之間發生了4個堿基(CATC) 的缺失，導致由此往后排列編碼第5位氨基酸的密碼子變為終止密碼，使得合成的肽鏈縮短，從而嚴重降低了苯丙氨酸酶蛋白的活性發揮。

歷史的積淀和民族的交融發展，造就了西北地區復雜的遺傳背景，也導致本地區漢族PAH基因的遺傳和變異形成了自身的特點，無論是在突變基因種類、突變形式以及突變分布規律上，既包含中國北方其他省區常見的突變類型及規律，也能發現中國北方及南方其他省區尚未報道的新突變，這也從側面揭示西北漢族歷經數千年歷史發展，伴隨歷史、地理及民族融合等諸多因素影響，人口來源多樣繁雜，形成其鮮明的地域特征，這對于豐富完善我國漢族PAH基因突變譜提供重要理論依據，為有效降低西北地區PKU發病率，提高出生人口素質具有重要價值。