氨基糖分析檢測方法和應用的研究進展

藍 麗 陳昱錕 譚立清 蔣 雯 劉晗昱 侯向華　

氨基糖分析檢測方法和應用的研究進展

藍 麗1陳昱錕1譚立清1蔣 雯2劉晗昱2侯向華2

（1.中國科技開發院廣西分院，廣西 南寧 530022；2.廣西產研院新型功能材料研究所有限公司，廣西 南寧 530000）

氨基糖是一類存在于土壤微生物中及其殘留物中的化合物，常作為微生物殘留物的生物標識物。文章對土壤中有機質循環、微生物在土壤中的作用進行研究，對氨基糖的檢測技術、氨基糖的應用方面的研究進展進行敘述。

氨基糖；檢測技術；應用；研究進展

引言

氨基糖是一類糖的羥基由氨基所取代的化合物的總稱，是許多生物大分子如殼聚糖、抗生素、脂多糖、糖蛋白和黏多糖等的組成成分[1]。它是來源于微生物并具有較高的穩定性，是土壤微生物細胞壁的組成成分，氨基糖在土壤中的含量較低，且含量占土壤氮含量的比例不足10%[2]，它是土壤活性有機氮非常重要的組成成分，土壤礦物氮也是其主要來源[3]。

在土壤和水環境中，氨基糖是有機碳和有機氮的重要組成成分，在環境的碳氮循環中發揮著重要作用。由于其在不同生物體內的含量和組成結構不同，因此可以根據環境中氨基糖的結構組成來判斷有機質的成分[4]。在環境中，含量最豐富的兩種氨基糖是葡萄糖胺和半乳糖胺，它們多存在于細菌、藻類、古菌及無脊椎動物體內。此外，胞壁酸是只存在于細菌體內，是細菌細胞壁肽聚糖的主要組成成分之一。而甘露糖胺雖含量較少，且來源性不專一，但卻是一種不可忽視的氨基糖。它在藻類及細菌的殘留物中較為常見，是膜糖脂中唾液酸的結構骨架。

1　氨基糖分析檢測方法研究進展

氨基糖是江河湖泊、土壤及海洋等環境中的一種重要組分。近年來，氨基糖作為生物標識物，在環境科學、生命科學及地球科學等領域備受關注。最早檢測氨基糖的方法主要有光度法、電化學法和電泳法[5]等，但這些方法存在很多不足，例如檢出限較高、樣品雜質對其結果影響較大以及在復雜的環境中檢測受限。隨著儀器分析技術的發展，氣相色譜法、高效液相色譜等分析測試技術以其高靈敏度、檢出限低及準確度等優點成為檢測氨基糖的主要分析手段。

1.1　Elson-Morgan法

Elson-Morgan法的原理是在一定溫度條件下，氨基葡萄糖分子的2號碳原子上的氨基與過量的乙酰丙酮堿性溶液發生乙酰化反應，生成特定的N-乙酰衍生物。然后在酸性條件下，該衍生物與對二甲氨基苯甲醛發生絡合反應，生成紫色絡合物，在525 nm有最大吸收。該操作方法步驟繁瑣，重現性大，影響結果準確性因素較多，且不能特異性區分氨基葡萄糖和氨基半乳糖，只適用于肝素純品含量的測定[6]。

1.2　離子色譜法

離子色譜法是近年來出現的用來檢測糖類的一種新技術。其基本原理是在單糖和寡糖的pH值大于12的情況下，解離離子型物質的陰離子。這種檢測方法能明顯區分開氨基葡萄糖以及氨基半乳糖。為了對肝素藥物質量進行控制，田玉曄[7]利用離子色譜法對肝素中氨基糖的組成結構進行了分析，結果顯示，該法的重現性好，靈敏度也高。

1.3　氣相色譜法

1984年Barrie 等[8]提出了同位素比例質譜法，首先將經氣相色譜分離得到的有機物中的C燃燒生成二氧化碳，以及將N轉化為N2之后，在載氣的攜帶下進入同位素質譜儀進行檢測。Glaser 等[9]應用這種方法對土壤中的13C進行分析，進而研究微生物殘留物的穩定性。這種方法對近天然豐度的化合物檢測靈敏度高，但對于待檢測同位素化合物豐度較高時，其檢測準確性下降，還有可能污染檢測器，應用范圍受限。

Zhang[10]等提出氫離子火焰檢測法，將樣品與適量6 mol/L鹽酸于水解瓶中，在105℃條件下進行水解8 h，冷卻至室溫，加入肌醇，振蕩搖勻后過濾，將濾液進行真空干燥（殘余物溶于一定量蒸餾水中），用0.4 mol/L的KOH調pH值至6.6～6.8，離心，取上清液進行干燥，殘渣溶于3 mL無水甲醇，離心，上清液在N2下吹掃干燥，將將殘渣溶于1 mL水中，并加入N-甲基氨基葡萄糖，冷凍干燥。然后加入300 μL衍生化試劑，于70℃～80℃條件下加熱30 min～35 min，冷卻至室溫，加入1 mL乙酸酐加熱20 min，除去過量衍生化試劑，最后，將衍生物溶于乙酸乙酯—正己烷混合溶劑（v/v=1∶1），進行氣相色譜分析。這種方法樣品用量少、選擇性好、靈敏度高。

氨基糖化合物具有揮發性及熱穩定性相對較差、沸點高等特點，氨基糖主要以酰氨基糖的形式存在（如幾丁質、肽聚糖）于自然環境中，有研究表明在使用氣相色譜-氫火焰離子化檢測法檢測氨基糖過程中，自然界或微生物培養過程中的氨基糖苷類抗生素很有可能對部分氨基糖的定量造成干擾[11]。

質譜法與其他氣相色譜法相比，不同點在于質譜法是利用電子轟擊電離源或化學電離源的高能量，將經氣相色譜分析后的有機物按一定規律形成離子碎片，利用這些碎片信息對待測物進行定性定量分析[5]。有研究者通過研究表明氨基糖檢測化學電離源相對于電子轟擊電離源更合適，原因是化學電離源具有產生碎片少、靈敏度高等優點增加了甲烷氣體作為電離緩沖介質，高能電子束的能量被吸收后，通過離子作用到樣品分子上。這種方法具有高效分離和高靈敏度的優點。質譜法能提供同位素比值和分子結構信息，因此在土壤氨基糖的循環轉化研究領域應用尤其廣泛。

1.4　高效液相色譜法

高效液相色譜法的原理是以液體為流動相采用高壓輸液系統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后進入檢測器進行檢測。這種方法具有分離效能高、高靈敏度、分析速度快、分離效能高、應用范圍廣等優勢，適合分析高沸點、大分子、強極性、熱穩定性差的化合物。

高效液相色譜—熒光檢測法在氨基酸的檢測方面應用較多，而關于氨基糖的研究較少。例如Zelles等[12]利用此方法檢測出土壤中的氨基葡萄糖和胞壁酸，而Appuhn等[13]利用此方法實現土壤和根系水解物中四種氨基糖的定量，并實現自動化分析，使該方法更加方便快捷。而此方法之所以未在檢測氨基糖方面得到廣泛應用，有以下幾點原因。首先，氨基糖本身不具有熒光性，氨基糖需要衍生成適合熒光檢測器的化合物，而這種化合物又容易分解，操作條件需進行嚴格控制。其次，其檢測過程易受氨基酸的干擾，且中性糖不能與氨基糖同步檢測。

高效陰離子交換色譜—安培檢測法主要用于糖類及其衍生物的檢測。步驟為在100℃條件下，用3 mol/L鹽酸水解樣品5 h，將水解液分成兩份，水解液a用于氨基葡萄糖、氨基半乳糖以及氨基甘露糖的檢測，水解液b則用于胞壁酸的檢測。水解液a在進行中和之前加入內標物α-1-葡萄糖磷酸二鈉鹽水合物，最后進行高效陰離子交換色譜—安培檢測法分析[5]。這種方法不需要對樣品進行衍生處理，無預濃縮過程且不需有機溶劑，因其具有干擾小的優勢而被普遍應用。但這種方法也存在很多缺點，例如，胞壁酸的檢測與其它三種氨基糖的性質不同，若要實現胞壁酸的高回收率，會大大增加工作量。其次大氣中二氧化碳也可能會影響結果的重現性等。

高效液相色譜-同位素比例質譜法大致原理為樣品在經過高效液相色譜檢測后分離的有機物在液相中在氧化劑中通過高溫氧化成二氧化碳，二氧化碳在載氣的攜帶下從液相色譜中脫離出來，然后進入同位素比例質譜儀進行檢測。

超高效液相色譜-高分辨率質譜與普通的超高效液相色譜相比，具有系統穩定性更高、重現性好、分離能力強以及更具高通量等優點。Hu等[14]利用此技術實現了對土壤中游離氨基糖的檢測分析。但由于該方法技術尚未成熟且成本較高，因此此方法還未普遍應用。

1.5　紅外光譜法

紅外光譜法被用于樣品的定性分析較多，各個物質的含量可根據峰位置、吸收強度也將反映在紅外吸收光譜上進行定量分析。此方法具有樣品用量少，分析靈敏度高，操作簡便，耗時少，成本較低，無危險試劑的使用等特點，該方法應用于定量分析時誤差較大，因此被用于定量分析應用少。近幾年，有一部分研究學者利用紅外光譜法進行氨基糖的分析，Dick等[15]將此法用于氨基糖含量的測定，Zhang等[16]也利用此法對土壤中三種重要氨基糖的濃度進行了預測，并取得一定成果。

紅外光譜法檢測手段在組分分析方面可以達到微米級或者納米級的分析，此外二次離子質譜等方法在組分分析方面也具有非常明顯的優勢。這些分析方法可能在未來被廣泛用于氨基糖的分析。

2　氨基糖的應用研究進展

依據目前的研究來看，氨基糖多用于作為生物標識物，土壤氨基糖含量變化對觀察微生物固碳及土壤有機質動態變化具有重要意義[17]。而氨基糖在醫藥以及其它方面的研究相對較少。

2.1　作為生物標識物

氨基糖既是土壤中有機氮庫的重要組成部分（土壤中氨基糖態氮占土壤總氮的5%～10%），又是土壤微生物細胞壁殘留物質，主要來源于土壤微生物。除此之外，氨基糖還具有較高穩定性和具有明確的微生物來源，因此，研究土壤中氨基糖的積累效應對研究土壤中氮的微生物轉化過程的有效途徑具有重要意義[18]。因此，學者們大多采用氨基糖作為生物標識物，對土壤中有機質及微生物在土壤中的作用進行研究。李俊娣等[19]同樣利用氨基糖作為生物標識物，通過了解真菌和細菌殘留物的積累與轉化，來探究真菌和細菌在土壤有機質轉化中的作用，以此為理論依據，促進土壤養分的增加和微生物多樣性的提高，從而改善當地土壤環境。寧趙等[20]同樣利用氨基糖作為生物標識物，分析不同施肥處理條件下，從微生物標識物角度考慮微生物在稻田土壤有機碳在積累和轉化中的作用，為當地有機物替代肥料的實踐提供理論依據。呂慧捷等[21]通過研究不同肥料配施后玉米不同時期的氨基糖含量變化，來推斷微生物來源物質的轉化遷移特征，對土壤有機質循環和土壤微生物對碳氮的截獲有重要意義，也為土壤有機質的循環周轉的關鍵因子的揭示提供重要理論基礎。Zhang等[22]研究了土壤氨基糖含量與土壤微生物化學性質之間的聯系，來探究微生物殘留C和土壤環境因素之間可能存在密切關系。井艷麗等[23]采用氨基糖作為微生物殘留物的生物標識物，來探究引入固氮樹種對遼東落葉松人工林土壤團聚體氨基糖的影響。王等倩[24]研究長期連作棉田土壤中氨基糖的含量和組成變化，旨在評價棉花長期連作及秸稈還田對土壤有機質轉化積累的微生物群落的影響。

2.2　在醫藥方面的應用

近年來，氨基糖在醫藥方面的影響日漸顯著。有研究學者發明一種氨基糖與金納米復合材料，這種材料對細菌細胞壁有破壞作用，且利用革蘭氏陰性菌和陽性菌細胞壁結構的不同，來抑制革蘭氏陽性菌的生長[25]，最終達到保護益生菌和維持腸道菌群平衡的作用。

此外，隨著醫療水平的進步，氨基糖在治療腫瘤方面也取得了顯著療效。隨著人們生活水平的提高，腫瘤在人們的日常生活中越來越普遍，時刻威脅人類的生命安全。而氨基糖類藥物能夠調節宿主細胞的免疫能力，進而使胸腺細胞的免疫能力能夠正常發揮作用，減少毒細胞對宿主細胞的侵害。其次，此類藥物還能一定程度上加快T淋巴細胞的生長，促進牛白介素的生成，牛白介素直接激活殺傷細胞，進而殺傷細胞直接殺死腫瘤細胞[26]。牛白介素還能加快殺傷性T細胞的成熟度，進一步促進腫瘤細胞的殺死及清除。

抗阿爾茨海默病是老年人身邊的常見疾病之一。加強抗阿爾茨海默病的治療水平成為醫學上正在攻克的難題。研究表明，氨基糖類藥物對抗阿爾茨海默病的防治和治療有積極作用。抗阿爾茨海默病的發病原理就是糖胺聚糖與序列中肝素的結合位點結合，從而抑制a酶的分泌，促進b酶（促進AI3的產生）的分泌。此外，糖胺聚糖還能加強蛋白酶磷酸化，從而抑制相關蛋白和微管的結合，誘發阿爾茨海默病的產生。而氨基糖類藥物能夠抑制氨基聚糖的形成，且能使患者自身線粒體得到修復[27]，對抗阿爾茨海默病具有一定的治療作用。

氨基糖類藥物還可用于水凝膠的制作。具有生物相容性的氨基葡萄糖單糖衍生物和其他化合物共聚可以得到全新的微凝膠，新型微凝膠由于具有良好的生物相容性、組織靶向性和對溫度、pH的刺激響應性，被廣泛用作緩釋藥物的載體[28]。研究表明，將氨基糖應用于水凝膠的制作，對于水凝膠的性能的提升具有重要意義[26]。

2.3　在農作物方面的應用

現今，香蕉枯萎病已嚴重影響香蕉種植業的發展，這是由一種尖孢鐮刀菌古巴專化型菌引起的植物疾病。該菌產生的厚垣孢子在土壤、腐殖質以及非寄主植物中可生存長達幾十年。研究學者通過氨基糖的添加實驗證明，添加氨基糖N-乙酰葡糖胺可抑制厚垣孢子的形成[29]。該研究為尖孢鐮刀菌古巴專化型厚垣孢子的形成和侵染機理提供了理論基礎。

2.4　在其他方面的應用

除此之外，氨基糖在實驗儀器上也有所應用。ZSM-5是一種具有獨特微孔結構的沸石分子篩。劉宇[30]認為氨基糖的加入有助于分子篩的生長，因此在氨基糖等的輔助下，利用晶種法成功的合成ZSM-5沸石分子篩。在自然界中儲量豐富的生物相容性良好、可生物降解的自然資源甲殼素為原料制備的氨基糖類表面活性劑是一類新型綠色高效表面活性劑，其具有良好的表面活性、乳化性等性質，預期在石油、食品、紡織印染、環保等領域應用[31]。

3　氨基糖研究存在的問題及應用前景

氨基糖可以用在醫藥、農作物和生物標志物等領域，對研究環境中碳、氮循環路徑、氨基糖材料等都具有非常重要的意義。因此，對氨基糖分析的方法的研究受到越來越多領域的科研工作者的重視。本文總結了氨基糖的各種分析方法，并對其應用領域進行了詳細介紹。近年來科研人員對氨基糖及其衍生物的研究正不斷完善，使人們對氨基糖的應用有更完善的認知。因此，對土壤中氨基糖含量的變化特征、氨基糖藥物載體等各方面的研究具有重要意義。

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Research Progress on Analytical Method and Application of Amino Sugar

Amino sugars are a kind of compounds that exist in soil microorganisms and their residues. They are often used as biomarkers of microbial residues. This paper studies the circulation of organic matter in soil and the role of microorganisms in soil, and describes the research progress in the detection technology and application of amino sugar.

amino sugar; detection technology; application; research progress

O622

A

1008-1151(2022)03-0041-04

2021-12-28

藍麗（1970－），女，中國科技開發院廣西分院工程師，從事科技項目評估、驗收工作。