微藻生物強化對藻-菌顆粒污泥的形成影響及污染物去除研究

肖亞兵，張雪純，季 斌，樊 杰，郭紹東

武漢科技大學城市建設學院，湖北 武漢 430065

目前，在工程實踐中需要實現生態和環境的可持續發展目標. 藻-菌顆粒污泥(microalgal-bacterial granular sludge, MBGS)由于具有較低的能耗需求、較少的碳排放和潛在的資源回收價值而受到污水處理領域越來越多的關注[1-3]. 由于微藻光合作用產生的氧氣可被細菌用于有機物的氧化，而細菌產生的二氧化碳可被微藻利用而產生氧氣[4-5]，而易沉降的藻-菌生物質可被進一步用作能源/資源的原材料[1,6].因此，MBGS有望同步實現水-資源-能源的回收，符合環境可持續的理念.

MBGS的培養是MBGS工藝應用的重要前提.研究[7]表明，MBGS可通過好氧顆粒污泥(aerobic granular sludge, AGS)培養形成，其藻種來源于顆粒污泥本身，具有不確定性，因此也很難確定MBGS中的優勢微生物尤其是關鍵藻種. 如Zhang等[8-9]通過AGS培養得到MBGS的關鍵藻種屬于藍藻，而Zhang等[10]培養得到的MBGS關鍵藻種為綠藻.

生物強化可作為MBGS的培養方式之一. 已有研究通過培養小球藻接種活性污泥的方式得到MBGS[11-12]，也有研究通過接種小球藻和柵藻強化AGS的方式獲得MBGS[13]. 然而，關于不同微藻的生物強化過程及關鍵藻種的作用還有待進一步研究. 因此，本研究通過微藻生物強化AGS的方式培養MBGS，分別向序批式光生物反應器中投加小球藻(R1反應器)、小球藻和斜生柵藻(R2反應器)以及小球藻、斜生柵藻和鮑氏細鞘絲藻(R3反應器)，并對形成的MBGS理化特性、污染物去除以及微生物群落結構進行系統研究，以期進一步理解通過AGS培養MBGS的過程及關鍵藻種的作用機理.

1 材料與方法

1.1 試驗裝置和操作

試驗裝置采用圓筒狀序批式反應器，內徑約為10 cm，高徑比為8，有效容積約為6.0 L. 該研究使用的AGS通過He等[14]的方法進行培養. 序批式反應器(sequencing batch reactor, SBR)在厭氧/有氧/缺氧(A/O/A)模式下運行，周期為8 h，其中進水時間3 min，厭氧階段120 min，好氧階段210 min，缺氧階段142 min，沉淀2 min，排水3 min，體積交換率為50%(每個循環3.0 L). 研究開始時，R1、R2和R3反應器的混合液懸浮固體(MLSS)濃度約為5 g/L，5 min污泥體積指數(SVI5)約為40 mL/g. 光源為圓筒中部的LED燈(4 000 lx)，反應器在(25±3) ℃條件下運行.該試驗開始前15 d為常規AGS穩定運行階段，之后向反應器中分別加入小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，小球藻和斜生柵藻(Scenedesmus obliquus)，小球藻、斜生柵藻和鮑氏細鞘絲藻(Leptolyngbya boryana)，微藻接種質量比均為1.0% (以干質量計).

1.2 合成市政廢水成分

該研究使用以下組成的合成廢水：COD (化學需氧量，CH3COONa)濃度約為320 mg/L，NH4+-N (氨氮，NH4Cl)濃度約為35 mg/L，PO43--P (磷酸鹽，KH2PO4)濃度約為9 mg/L，10 mg/L CaCl2和1 mL/L微量元素溶液(10 mg/L EDTA，0.15 mg/L H3BO3，0.10 mg/L MnSO4·H2O，0.03 mg/L CuSO4·5H2O，0.12 mg/L ZnSO4·7H2O，0.06 mg/L Na2MoO4·2H2O，0.18 mg/L KI和0.15 mg/L CoCl2·6H2O). 使 用0.1 mmol/L HCl和NaOH將合成廢水的pH調至6.5±0.1.

1.3 分析方法

COD、TN、NH4+-N和TP濃度按照標準方法測定[15]；酸堿度(pH)和溶解氧(DO)濃度分別采用pH計〔ST3100，奧豪斯儀器(常州)有限公司〕和溶解氧儀(JPB-607A，上海儀電科學儀器公司)測定；從試驗開始，以10 d為一周期，通過標準方法測定SVI以及葉綠素a、葉綠素b、MLSS和MLVSS的濃度；采用激光粒度儀〔Hydro 2000SM，微平科技(廣州)有限公司〕測定MBGS粒徑分布；胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)采用改進的熱提取方法[16]提取，且其組成成分采用熒光分光光度計(F-7100型，日本日立公司)測定；蛋白質(PN)和多糖(PS)分別通過改良的Lowry法[17]和硫酸-蒽酮比色法[18]測定.

1.4 微生物群落分析

通過Illumina Miseq測序和顯微鏡檢查研究了微生物群落. 為進行真核、原核生物群落分析，在第20、40、60天分別收集R1、R2和R3反應器的污泥樣 本. 使 用OMEGA試 劑 盒(OMEGA Biotek Inc.,Norcross, GA, USA)提取DNA，并采用Nanodrop和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量. 原核、真核生物16S rRNA的擴增引物組分別為338F-806R和528F-706R[19]. 16S rRNA基因序列可在NCBI(http://www.NCBI.nlm.nih.gov/sra)上獲得，登錄號為PRJNA631461.

1.5 統計分析

使用SPSS 25.0軟件進行單因素方差分析(one way ANOVN)，分析污染物去除率與理化特性的統計差異，如果P＜0.05，則表明存在統計學顯著性差異，反之P＞0.05，則表示無顯著性差異.

2 結果與討論

2.1 顆粒特性

2.1.1顆粒沉降性能及粒徑分布

R1、R2和R3反應器初始MLSS濃度分別為(4.9±0.1)(4.9±0.1)和(5.2±0.1) g/L. 在該研究過程中3個反應器MLVSS濃度維持在(3.5±0.4) g/L. 接種微藻后，3個反應器SVI值都有所增加，這可能是由于微藻生長和細菌之間營養競爭，導致EPS分泌量在一定程度上有所增加引起的[8]. 經過30 d的培養，R1、R2和R3反應器中的MBGS均表現出了良好的沉降性能〔見圖1(a)〕，其穩定時的SVI5/SVI2分別為0.985、0.994、0.994，表明MBGS沉降性能較好. 另外，穩定期R2和R3反應器形成的MBGS粒徑較R1反應器略大〔見圖1(b)〕，表明斜生柵藻的接種有可能利于MBGS粒徑增長.

圖 1 3個反應器中藻-菌顆粒污泥的沉降性與粒徑分布Fig.1 Sludge settling property and granular size distribution of microalgal-bacterial granular sludge in 3 reactors

2.1.2胞外聚合物

EPS在維持MBGS穩定性和藻菌共生結構中有著至關重要的作用[4,20-27]. 3D-EEM光譜圖顯示了EPS成分(見圖2). 如Chen等[28]的報道，峰B1、B2、B3與酪氨酸等簡單芳香蛋白有關，峰A1、A2、A3與可溶性微生物副產物；峰C1、C2與腐殖酸有機物有關，而峰B2、B3也與類富里酸物質有關. 由圖2可明顯觀察到，R1反應器與R2、R3反應器 EPS成分(酪氨酸等簡單芳香蛋白、可溶性微生物副產物、腐殖酸、類富里酸)[28]存在顯著性差異，而R2反應器與R3反應器在EPS組成上相似.

圖 2 3個反應器中藻-菌顆粒污泥EPS的3D-EEM光譜Fig.2 3D-EEM spectra of the EPS of microalgal-bacterial granular sludge of 3 reactors

2.2 污染物去除

R1、R2和R3反應器對COD去除率如圖3(a)所示. AGS系統第一階段COD平均去除率分別為92.3%、93.1%、93.2%. 經過第二階段適應期，3個反應器在第三階段穩定期COD平均去除率分別達到98.3%，98.0%，99.3%〔見圖3(a)〕. 該結果表明，相比AGS系統，穩定后的MBGS系統具有更高的有機物去除率. 而由于3個反應器表現出相似的COD去除率(P＞0.05). 因此，在R1反應器中接種小球藻的基礎上再接種一至兩種微藻(斜生柵藻、鮑氏細鞘絲藻)不會顯著影響COD的去除率，這與Fan等[11,29-30]的研究結果類似.

圖 3 COD、NH4+-N、TN、TP進出水濃度及去除率Fig.3 Variations of concentrations of COD, NH4+-N, TN, TP of influent and effluent and the removal efficiency

第一階段，R1、R2和R3反應器NH4+-N平均去除率分別為97.8%、98.7%、98.7%〔見圖3(b)〕. 接種微藻后的適應期，NH4+-N去除率快速下降. 穩定后的MBGS系統，NH4+-N平均去除率分別為98.9%、99.5%、99.5%〔見圖3(b)〕. 由此可得，MBGS系統去除NH4+-N的效能優于AGS系統. 另外，穩定后的MBGS系統和第一階段AGS系統對TN去除率均高于70%〔見圖3(c)〕，但無顯著差異(P＞0.05).

如圖3(d)所示，R1、R2和R3反應器在第三階段TP平均去除率達到93.2%、96.5%、98.2%，相較第一階段TP的去除率，說明小球藻的接種可顯著提高磷的去除率[31]. R2、R3反應器與R1反應器相比，磷去除率分別增加3.3%、5.0%(P＜0.05)，另外R2與R3反應器在磷的去除方面也具有顯著性差異(P＜0.05).以上結果表明，微藻強化對反應器生物除磷有顯著提高作用.

2.3 微生物群落

2.3.1原核生物群落

Illumina Miseq測序分析了3個反應器第20、40、60天的9個樣品，每個樣品有效序列量在90 000~130 000之間，OTU數量在2 100以上，香農威納指數和辛普森指數分別在6.7、0.94以上. 如圖4所示， 變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)和浮霉菌門(Planctomycetes)這4個菌群的豐度總和占90%左右(見圖4). 這些細菌多為異養菌，可為有機物的高效去除提供保障. 另外，硝化螺旋菌門(Nitrospirae)可實現亞硝酸鹽的氧化[32-33].β-變形菌的紅環菌科(Rhodocyclaceae)為除磷的主要貢獻者[34]，其在R1、R2和R3反應器的相對豐度分別為18.6%、26.8%和39.6%. 微纖毛蟲科(Microscillaceae)具有分泌多糖的功能[35]，有利于MBGS顆粒的結構維持. 伯克氏菌科(Burkholderiaceae)具有降解有機物的潛能[36]，對COD的去除可能有重要貢獻.

圖 4 3個反應器原核生物在門分類水平上的組成Fig.4 The compositions of prokaryotes in 3 reactors at the phylum level

2.3.2真核生物群落

由圖5可以看出，R1、R2、R3反應器真核微生物主要包括輪蟲門(Rotifera)、綠藻門(Chlorophyta)、子囊菌門(Ascomycota)、隱霉菌門(Cryptomycota). 輪蟲的出現反映了MBGS良好的沉降性. 接種微藻后，R3反應器未檢測出藍藻，表明鮑氏細鞘絲藻在藻類競爭中被淘汰，而綠藻門有明顯增加，最終R3反應器形成了與R2反應器功能微生物類似的MBGS系統.

圖 5 3個反應器真核生物在門分類水平上的組成Fig.5 The compositions of eukaryotes in 3 reactors at the phylum level

3 結論

a) 相比AGS系統，MBGS系統具有更優的沉降性和更高的污染物去除率.

b) 相比加入小球藻的R1反應器，投加小球藻與斜生柵藻的R2、R3反應器具有更高的污染物去除率，說明斜生柵藻的投加有利于MBGS的污染物去除.

c) 斜生柵藻的投加有利于促進微生物EPS的分泌，從而維持MBGS的結構和功能.