牛奶蛋白過敏相關微小RNA的研究進展

譚超元 綜述 朱達堅 審校

廣東醫科大學，廣東 湛江 524000

牛奶蛋白過敏(cow's milk protein allergy，CMPA)是兒童期最常見的食物過敏之一，據報道全球CMPA發生率為2.5%～3.0%[1]。CMPA 的臨床表現主要為過敏原導致消化道黏膜損傷而引起的消化道癥狀，主要表現為嘔吐、腹痛、腹脹、腹瀉、消化道出血等[2]。CMPA 病因機制復雜，現尚未完全了解清楚；目前基本確定CMPA是由免疫調控異常引起，其中涉及多種細胞及其細胞因子，如CD4+T輔助(Th)細胞、調節性T(Treg)細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞(DC)、B 細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞和白細胞介素-1 (IL-1)、白細胞介素-4 (IL-4)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-8(IL-8)、白細胞介素-10(IL-10)、轉化生長因子-β(TGF-β)等。微小RNA(MicroRNA，MiRNA)是細胞中一類進化保守的短的單鏈非編碼RNA 分子，長度約為19～24 個核苷酸，可在多種細胞中大量表達，包括嗜酸性粒細胞、肥大細胞、嗜堿性粒細胞、2 型先天淋巴樣細胞(ILC2)、交替激活的巨噬細胞(AAM)、T輔助(Th)2 細胞、T 調節(Treg)細胞和B細胞等[3]。MiRNA 被認為是在轉錄后抑制水平上控制多種生物過程的負調控因子，是過敏性免疫反應的重要調節劑，在過敏反應中起著重要而古老的作用。MiRNA 在過敏性疾病(如哮喘)中發揮的作用已有較多研究成果，但目前對MiRNA 在CMPA 中的分子機制和功能的了解較少，近年來已有研究結果提示MiRNA 是CMPA 的重要調節劑，通過精密的機制來嚴格控制先天性和后天性免疫應答的激活以控制它們的發作和終止[4]。最近也發現特定的MiRNA 在調節CMPA 的關鍵細胞具有重要作用，包括嗜酸性粒細胞(MiRNA-21、MiRNA-135、MiRNA-146、MiRNA-223)、肥大細胞(MiRNA-155、MiRNA-223、MiRNA-142、MiRNA-221)、巨噬細胞(MiRNA-124、MiRNA-146、MiRNA-155)、CD4+Treg 細胞(MiRNA-155、MiRNA-193、MiRNA-21、MiRNA-128、MiRNA-27)等[5-6]。本文將對CMPA 中有關MiRNA 的免疫調控病因機制方面的研究進展進行綜述。

1 MiRNA-193a

MiRNA-193a 是位于人類17q.11.2 染色體上由22個核苷酸組成的非編碼RNA，在進化過程中以成熟形式高度保守表達[7-8]。有研究報道Ig-E 介導的CMPA患兒在6 個月飲食干預治療后，MiRNA-193a 的表達水平相比未治療前顯著增加[9]，說明機體受到牛奶過敏原刺激時可能會減少MiRNA-193a 的表達，對機體的免疫系統產生調控作用。由于Ig-E 型過敏反應是機體再次接觸過敏原時，Th2細胞功能失調，產生大量IL-4，進而釋放炎性介質所致[10]；而MiRNA-193a 是IL-4 表達的轉錄后調節因子，有研究報道使用MiRNA-193a抑制劑轉染Ig-E介導的CMPA患兒外周血中CD4+T 細胞，結果顯示IL-4 mRNA 及IL-4 表達顯著上調[11]；上述結果提示MiRNA-193a 可能通過負向調控IL-4 mRNA在IgE 介導的CMPA中發揮作用，從而抑制CMPA的發生發展。另外，IL-4 mRNA可通過抑制PepT1(寡肽轉運蛋白1，一種二肽/三肽轉運蛋白)轉錄并隨后抑制核因子κB(NF-κB)通路，后者是針對先天免疫應答信號蛋白的抑制通路[12]；有研究結果發現MiRNA-193a 可降低目標基因PepT1 的表達與活性[13]，結果提示MiRNA-193a 可能通過IL-4 mRNA 以及NF-κB 通路在CMPA 病因機制中發揮作用。而D'ARGENIO 等[11]的研究也表明，在CMPA患兒中MiRNA-193a 水平較正常患兒顯著降低，但已獲得牛奶免疫耐受的兒童中MiRNA-193a水平卻與正常兒童水平相似，且活躍期CMPA 患者的MiRNA-193a表達明顯低于健康對照者，這進一步證實了MiRNA-193a 在IgE 介導的CMPA 發病中的調節作用，因此MiRNA-193a 可能是童年時期常見病CMPA的新穎治療靶標。

2 MiRNA-155

MiRNA-155 是由非編碼RNA BIC (B 細胞整合簇)基因轉錄而成的，最初被確定為一種具有免疫調節功能的微小RNA[14-15]。MiRNA-155 影響CMPA 的發展原因在于它可能通過IL-4和Th2細胞抑制腸道黏膜的損傷，OKOYE 等[16]通過轉錄組學發現MiRNA-155在腸道損傷組織和Th2 細胞中的含量顯著上升；已經證明CMPA發病機理與Th2細胞功能失調和及其釋放的細胞因子IL-4 過多有關[10]；當靶向抑制Th2 細胞中的MiRNA-155時，鞘氨醇1 磷酸酯受體1(S1pr1)以及IL-4 的調控基因Fizz-1、Arg-1 轉錄表達上升，證明MiRNA-155 可以通過控制S1pr1 的表達和IL-4 的生成來調節Th2 細胞介導過敏反應的功能[16]；在腸道T細胞中，MiRNA-155 也可在轉化生長因子(TGF)的作用下調節腸道細胞因子和免疫反應[17]；上述研究表明MiRNA-155 可能通過調節Th2 細胞和IL-4 在CMPA的發病機制中發揮重要作用。另外有研究者發現MiRNA-155是初母乳中最主要的外泌體，并且可被腸道巨噬細胞吸收，并隨后增加細胞中MiRNA-155 的水平，且已有證據表明生命早期食用母乳是嬰幼兒特應性疾病發展的保護因素[18-19]，這也解釋了母乳喂養發生CMPA 的患兒要比普通奶粉喂養的患兒少的原因。動物模型證明了CMPA 與CD4+Treg 細胞的損傷或失調有關，并且Treg 細胞對于增強機體對牛奶的耐受性至關重要[5，20]；有研究表明，在牛奶蛋白過敏小鼠中使用非消化性低聚糖(FOS)可以增強口服免疫治療(OIT)的效果，其原因可能是因為增加了腸系膜淋巴結中Foxp3+Treg 細胞的水平[21]。MiRNA-155通過其靶標細胞因子信號傳導1 抑制因子(SOCS1)維持STAT5 活性，從而進一步增強Treg 細胞的分化[22]；另外，MiRNA-155 參與Treg 細胞的分化，并通過表達叉頭蛋白3 (Foxp3)促進其發育并減少IL-4的產生從而達到預防Th2 細胞介導的過敏反應的作用[18，23-24]；飲食干預研究中，使用含有益生菌的廣泛水解酪蛋白配方對CMPA 患兒進行飲食干預后發現其外周血MiRNA-155 表達增加明顯更高，并且Treg 細胞中FoxP3 去甲基化率的顯著增加[9]，這為MiRNA-155 在預防CMPA 的作用機制提供了進一步的論證。

3 MiRNA-146

MiRNA-146位于人q34 染色體上，主要由白細胞表達，分為MiRNA-146a與MiRNA-146b，其功能與炎癥和免疫反應有關[25-26]。黏膜免疫系統的完整發育是CMPA 獲得免疫耐受的條件之一[27]；MiRNA-146 是調節腸道菌群免疫系統發育的介質，可以靶向加速腸道組織和免疫系統發育的基因表達[28]。MiRNA-146a對CMPA 的調節作用也與Treg 細胞有關，研究表明Treg 細胞中MiRNA-146a 的缺失會導致外圍功能不良的FoxP3+Treg 細胞數量增加致使機體的免疫耐受性被破壞[29]；用肽聚糖誘導激活NF-κB 通路增加Treg 細胞相關的細胞因子可減輕小鼠β-乳球蛋白過敏的過敏性炎癥[30]；在NF-κB 驅動下，MiRNA-146a 通過Toll 樣受體(TLR)在免疫系統的穩定中發揮作用[31-32]；說明MiRNA-146a 可以通過Treg 細胞調節CMPA 的發生發展。有證據表明MiRNA-146b是在小鼠哮喘模型試驗中始終被上調的唯一MiRNA，通過減少腫瘤壞死因子超家族-9(TNFRSF9)的生成來促進過敏性哮喘的發展[33]。但是最近有研究者報道IL-10缺陷型小鼠的腸道巨噬細胞中缺乏MiRNA-146b 的表達，在他們的后續研究中證實MiRNA-146b 缺陷型小鼠更容易發生腸道炎癥并增強了M1 巨噬細胞的活化[34]，提示MiRNA-146b 具有抑制腸道炎癥的作用。基于現如今關于MiRNA-146 對CMPA 的調節機制研究較少，且MiRNA 具有復雜的調節機制，因此對MiRNA-146 參與CMPA 進行更深入的研究可能有助于CMPA 患兒發病機理的進一步理解。

4 其他相關MiRNA

已經表明Let-7 MiRNA 是肺部過敏性疾病所必需的，Let-7 MiRNA 通過其靶標IL-13 和兒茶酚胺受體b2-腎上腺素能受體(adrb2)發揮作用[35]；浙江大學附屬兒童醫院的一項研究也表明哮喘嬰兒肺泡灌洗液中MiRNA-Let 家族(7a、7b 和7c)的表達與對照組相比均顯著增加[36]；CHAO 等[37]通過大鼠內臟超敏反應模型亦支持Let-7 MiRNA在腸道過敏反應的表達上調；證明Let-7 MiRNA 可能在CMPA 發病機制中占有重要地位，但具體調節機制仍需進一步探究。

另外有報道指出MiRNA-124 可以通過靶向卷曲螺旋蛋白激酶1(ROCK1)抑制TLR-9 的表達，促進腸道炎性細胞浸潤[38]；過敏患者中的CD14+、CD16+中間單核細胞數量增加，并且高表達MiRNA-124[39]；說明MiRNA-124 對腸道過敏性炎癥具有一定的促進作用。最新的研究也發現在β-乳球蛋白過敏小鼠和正常小鼠的結腸中共檢測到15 種差異表達的MiRNA，其中有六個MiRNA 上調(如MiRNA-19a、MiRNA-224 和MiRNA-106a 等)以及九個MiRNA 下調(如MiRNA-30a、MiRNA-150 和MiRNA-194等)[40]。以上研究已初步顯示出MiRNA調節免疫反應功能及機制，特別在哮喘患兒中已確定部分MiRNA 調控高氣道反應的分子機制，但對于CMPA 來說MiRNA 的調控機制研究較少，仍需進一步探索其中的發病機理。總結MiRNA 調節CMPA 通路見圖1。

圖1 MiRNA在CMPA中的作用機制和通路

5 小結

以上這些研究表明，MiRNA可以通過調節其靶細胞、靶目標、細胞因子或受體通路影響CMPA 的發生發展。作為CMPA中的內源性調節劑，MiRNA可以增強或減少CMPA 患兒的過敏反應，并提示MiRNA 的復雜網絡會影響CMPA 的免疫反應。現在國內外各種CMPA 指南推薦采用飲食回避的方式或者高水解蛋白配方替代喂養以及對癥處理[2，27，41]，其或多或少會導致各種并發癥如生長發育障礙、營養不良、誤接觸牛奶導致過敏反應等，OIT 是近幾年來發現比較有前景且有效的CMPA 治療方法[42-43]。OIT 可以促進部分MiRNA 增強Treg 細胞發揮其免疫耐受作用，但現如今對MiRNA 的研究仍較少，需要更多的研究來探索這些相應的調節機制。總之，MiRNA在CMPA中的作用才剛剛開始探索，需要進一步的研究來揭示MiRNA在CMPA發展中的全面影響，以及揭示其在CMPA中作為治療靶標和新型生物標志物的潛力。