植物類過敏原多重核酸檢測技術研究進展

◎ 曾曉琮，陳茵茵，韓志杰，蘇章庭，周 露

（廣東省食品檢驗所，廣東 廣州 510435）

食物過敏是指過敏原蛋白引起人體異常或超常的免疫反應，已成為備受關注的全球性公眾健康和食品安全問題。近日，中國疾控中心英文周報發表了一系列關于中國人食物過敏的研究論文，對我國不同人群的食物過敏情況進行了詳細分析，研究結果表明我國食物過敏的患病率呈上升趨勢。據報道[1]，嬰兒的食物過敏率在歐洲和美國是1%～5%，在中國是7%，在澳大利亞則超過10%。植物蛋白類食品因為“天然、綠色、營養、健康”等特點受到人們的喜愛，但另一方面，植物類過敏原食品安全問題也受到越來越多關注[2]。《預包裝食品中的致敏原成分》（GB/T 23779—2009）和《食品安全國家標準 預包裝食品標簽通則》（GB 7781—2011）規定了4類可能導致過敏反應的植物性食品及其制品。①含有麩質的谷物及其制品（如小麥、黑麥、大麥、燕麥、斯佩耳特小麥或它們的雜交品系）。②花生及其制品。③大豆及其制品。④堅果及其果仁類制品。植物類過敏原可引起不同的癥狀，如麩質過敏可能導致口部咽喉部蕁麻疹，鼻塞、頭痛，呼吸困難，惡心嘔吐，腹瀉；花生過敏可能導致血壓降低，面部喉嚨腫脹，嚴重時引起過敏性休克；大豆過敏可能引起皮膚紅癢，哮喘及過敏性鼻炎、腹痛腹瀉；堅果過敏可能引起口中產生金屬味道、舌頭或喉水腫大、呼吸困難、吞咽困難、全身蕁麻疹、痙攣性腹痛、惡心[2]。目前對于過敏疾病尚無有效治療手段，避免攝入含過敏原食物仍是最有效的預防方式，采用高效的檢測技術對確保食品標簽準確具有重要意義。

過敏原檢測主要有基于蛋白水平的免疫學技術和基于基因水平的分子生物學技術，兩種技術各有長處。我國現有過敏原檢測標準有出口食品過敏原成分檢測系列標準和出口食品常見過敏原LAMP系列檢測方法系列標準，在41個標準中有39個標準介紹核酸檢測方法，2個標準介紹免疫學方法，基于標準大部分介紹核酸檢測方法，但都是針對單一過敏原的現狀，本文著重綜述植物類食物過敏原多重核酸檢測技術，包括多重PCR技術、基因芯片技術、宏基因測序技術，以期為植物類食品過敏原檢測標準研發及食品安全風險防控提供參考。

1 多重PCR技術

多重PCR技術是指針對食品中多種成分的目的基因，設計引物組合，在一個反應體系中計入2對或2對以上的特異性引物，分別擴增不同目的基因，實現同時檢測多個目的基因[2]。

PAFUNDO等[3]結合SYBR?GreenER?技術建立腰果、扁桃仁、芝麻、花生、榛子的5重qRT-PCR方法，檢測靈敏度達0.5 pg DNA，定量標準曲線R2＝0.999 8。王瑋[4]根據芝麻2S albumin mRNA基因、燕麥Avenin基因、胡桃Jug r 2基因、榛果Oleosin基因、杏仁Pru du 1基因芥末Sin a I基因、芹菜Mtd基因、羽扇豆核糖體內轉錄間隔區（ITS）基因設計引物，采用2組4重PCR擴增，建立了芝麻、燕麥、胡桃、榛果、杏仁、芥末、芹菜、羽扇豆8重qRT-PCR方法，檢測限為100 pg。程芳[5]建立了針對美洲山核桃、大豆、小麥、大麥、榛子、腰果、花生、芝麻、燕麥、開心果10重普通PCR方法，結合毛細管電泳，檢測靈敏度達20 copies，能檢出含量在10.000%、5.000%、2.000%、1.000%、0.500%、0.100%、0.050%、0.010%、0.005%范圍的過敏原。汪永信等[6]根據大豆atp A基因和芹菜mtd基因設計引物，建立TaqMan探針qRT-PCR方法，同時檢測大豆和芹菜，對大豆、芹菜、花生、芝麻、玉米、大米、小麥、大麥、馬鈴薯、杏仁、蘋果、蕃茄、核桃、葵花籽、開心果、腰果、梨、草莓、羊肉、魚肉、豬肉、牛肉等材料進行檢測，僅大豆和芹菜出現特異性擴增，檢出限為0.01%。PIERBONI[7]根據大豆的Glym3、Glym5、Lectin基因和花生的Arah1、Arah2基因設計引物，建立了同時檢測大豆和花生的數字PCR方法，并與qRT-PCR和ELISA作對比研究。蘭海鷗[8]針對花生Ara hl基因、核桃Tugr 1基因、大豆Gly m Bd 28k基因設計引物，建立花生、核桃、大豆三重qRT-PCR方法，拷貝數最低檢測限為花生1.50×103copies·μL-1、 核 桃 1.50×102copies·μL-1、大豆 1.50×102copies·μL-1。最低檢測限為花生 1 ng·μL-1DNA、 核 桃 0.1 ng·μL-1DNA、 大 豆 0.01 ng·μL-1DNA。王鳴秋[9]建立榛子、核桃、花生、杏仁、大豆、芝麻的六重過敏原成分檢測方法，根據多拷貝ITS基因，設計6組特異性雜交探針，對20多種相關植物、動物及微生物進行多重連接探針擴增，特異性強，檢出限為5 mg·kg-1，并通過30份不同種類食品樣品驗證。柯燕娜[10]根據小麥ω-醇溶谷蛋白（ω-gliadin）、大麥醇溶谷蛋白（Hordein）、黑麥ω-黑麥堿蛋白（ω-secalin）基因序列設計引物，建立同時檢測小麥、大麥和黑麥致敏原（WBR155 bp）的普通PCR方法，3種過敏原檢出限分別為1.00%、0.01%、0.10%，對14份樣品進行檢測，結果均與標簽標識相符合。

加工食品可能存在多種過敏原成分，相比單重PCR技術，采用多重PCR技術具有顯著的高效性，保留了傳統PCR特異性強、靈敏度高的特點，也節約了反應時間和試劑用量，是一種既經濟又高效的高通量檢測方法，但難度在于多對引物在同一體系內對不同目的片段進行擴增，準確擴增依賴于引物設計、反應溫度、循環條件、離子強度等條件設計，設計好引物探針是反應成功的關鍵，不合理的設計容易形成引物二聚體或非特異性擴增，造成假陽性。在遵循引物設計主要原則的基礎上，各引物對之間的最佳退火溫度應盡可能相同且無任何交互反應。

2 基因芯片技術

基因芯片技術是將引物探針與芯片結合，將預先設計好的探針固化在芯片基質上，通過核酸分子雜交，檢測每個雜交信號，獲知樣品的分子數量和序列信息[34]。BETTAZZI[11]針對榛子Cora 1.04 和Cora 1.03基因設計引物，建立基于低密度DNA微陣列檢測方法，檢測限分別可達 0.3 nmol·L-1和 0.1 nmol·L-1。WANG[12]建立了快速檢測腰果、蝦、魚、牛肉、雞、大豆、小麥和花生8種過敏原的基因芯片技術，腰果DNA的絕對檢出限為0.05 pg，實際檢出限為0.001%，PCR擴增后生物傳感器芯片檢測時間約為30 min。DAN[13]建立同時檢測榛子、花生、大豆過敏原的可視化基因芯片技術，先將LAMP擴增引物固定于芯片基質中，同時加入酸堿指示劑染料，當檢出目的基因時，擴增體系pH值變化導致染料變色，由此被生物傳感器檢測放大，實現快速高通量檢測，檢出限達 0.4 μg·mL-1。

基因芯片技術靈敏度高、特異性強，檢驗周期短，通過擴增曲線判定檢測結果的方式可以滿足可視化的要求，快速簡易，適用于現場的即時檢測，多重引物探針與微流控的組合是基因芯片技術的難點和重點。

3 宏基因測序技術

多重PCR技術和基因芯片技術可以實現多重過敏原靶基因檢測，大大提高了檢測效率，但不足之處是僅針對已知的過敏原靶基因定向檢測，對于未知的過敏原則無法檢測。到目前為止，有超過989種蛋白被世界衛生組織和國際免疫聯合協會認定為過敏原蛋白[14]。盡可能篩選識別出過敏原，實現非靶向檢測，現有多重技術還遠遠不夠。隨著基因測序技術的發展，高通量測序技術（High-Throughput Sequencing，HTS）又稱下一代測序技術（Next Generation Sequencing，NGS），以協同方式逐步進行酶促DNA反應、堿基測序與數據收集，可以同時完成數萬條到數十億條DNA模板的測序。NGS技術目前較多應用于摻雜摻假、微生物非靶向檢測，在過敏原非靶向檢測中較少。WANG[1]研究了一種雜交探針簇靶向的下一代測序（HPC-NGS）技術，用于高通量篩選食品系統中的潛在過敏原，研究收集了過敏原的公共序列以設計特定的探針簇，以從植物和動物來源的高通量宏基因組測序讀數中準確識別過敏原成分，通過HPCNGS成功捕獲了目標DNA片段，并在復雜的食品系統中鑒定了19種致敏成分，HPC-NGS在單一食品材料中的過敏原物種匹配率為94.24%～100.00%，在加工食品中的過敏原物種匹配率為99.87～99.98%。

4 結語

食品加工多元化帶來了食品品質的提升，但也可能在生產過程中帶入了食品過敏原潛在風險。在食品加工過程中，食品蛋白質容易出現變性、聚集現象，導致其線性表位及構象表位發生改變，采用基于蛋白水平過敏原檢測技術容易出現假陰性或假陽性，過敏蛋白相互間還可能會交叉免疫，相比之下，核酸水平分子生物學檢測技術在食品檢驗檢測領域應用廣泛，核酸檢測針對過敏原DNA，不易受到外界條件的影響，可避免近緣物種的交叉反應，更加便捷、有效。食品過敏原核酸檢測技術從普通PCR發展到qRT-PCR、數字PCR，從單重檢測發展到多重檢測。目前，生物芯片技術成為研究熱點，由于采用反向雜交技術，可實現單一樣品多種過敏原同時檢測、多個樣品多種過敏原的高通量檢測，值得研究推廣。此外，從過敏原核酸檢測技術研究可以看出，對過敏原基因的氨基酸序列進行生物信息學分析是開發過敏原檢測技術的關鍵環節，因此，不斷積累過敏原信息數據對未來開發更加高效的過敏原檢測技術和食品過敏原風險防控具有重要意義。NGS能實現高通量非靶向性檢測，將有利于篩查食物中的潛在過敏原，有利于解決食品中未知過敏原風險檢測篩查，值得進一步研究。