諾麗對氫化可的松致腎陽虛模型小鼠改善記憶的作用機制研究

張睿，邸松蕊，余淑惠，劉金蓮，湯如瑩，葛東宇，董瑞娟，張建軍

(北京中醫藥大學，北京 100029)

諾麗(Noni)原產于波利尼西亞群島，為茜草科海濱木巴戟(MorindacitrifoliaL.)的果實，廣泛分布于太平洋南部諸島和中南半島地區，當地人應用其強身健體治療各種疾病[1]，現代研究表明其具有強大的抗氧化能力[2]。目前諾麗已合法引入中國使用，國內市場已出現諾麗與人參配伍，諾麗與黃精配伍，諾麗與山茱萸、女貞子配伍等產品。在專利網站進行檢索，截至2021年5月共有407條諾麗相關專利，其中不乏與中藥配伍之品。有學者對南美草藥阿薩伊等一系列外來藥物進行了中藥藥性探討[3]，并明確了新外來中藥的概念[4]，提出了外來藥物“中藥化”的研究策略[5]。為使諾麗在我國更好地推廣應用，也為使其與中藥合理配伍，依據新外來中藥現代研究范式[6]，劉金蓮等[7]對諾麗文獻進行全面整理并首次進行系統的中醫藥理論分析，提出了諾麗的藥性為酸、甘、平,歸肝、腎、脾經，具有滋補肝腎、強筋健骨、益氣養陰之效。有研究表明諾麗可改善記憶[8]，但其作用機制尚不明確。本研究旨在通過觀察諾麗對氫化可的松致腎陽虛模型記憶損傷小鼠行為學、病理、神經遞質和cAMP/PKA通路蛋白的影響，揭示諾麗補腎改善記憶的作用機制，為諾麗歸腎經及補腎功效提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF雄性昆明小鼠60只，體質量(20±2)g，購自斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0002。飼養于北京中醫藥大學SPF級動物房，小鼠自由攝食和飲水。實驗符合相關倫理學要求。

1.2 藥物

諾麗干粉(美國大溪地諾麗公司，批號：US20180321)，人參配方顆粒(北京康仁堂藥業有限公司，批號：18006312)，氫化可的松注射液(天津金耀藥業有限公司，批號：1801181)。

1.3 試劑

環磷酸腺苷(cAMP)試劑盒、環磷酸鳥苷(cGMP)、磷酸激酶A(PKA)ELISA試劑盒(北京華英生物技術研究所，批號：20190812，20190815，20190823)；乙酰膽堿(ACh)、5羥色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、去甲腎上素(NA)ELISA試劑盒(江蘇科特生物科技有限公司，批號：MB3256B，MB3179B，MB3092B，MB3269B)。

1.4 主要儀器

Epoch2C型酶標儀(美國BioTek)，SleeMPS/P2型包埋機(德國SLEE)，RM2245型切片機(德國Leica)，全自動切片掃描儀Axio Scan.Z1(德國ZEISS)。

1.5 方法

1.5.1 分組與給藥

小鼠適應性喂養3 d后隨機分為6組，每組10只，即對照組,模型組,人參組(1.00 g/kg，相當于成人劑量6 g/d),諾麗高、中、低劑量組(1.33、0.67、0.33 g/kg，分別相當于成人劑量8、4、2 g/d)。從實驗開始第1天，每天除對照組、模型組灌胃雙蒸水外，其余各組每天下午灌胃相應藥物，連續14 d，灌胃容量為0.01 mL/g。

1.5.2 造模

除對照組外，其余5組每天上午灌胃氫化可的松(25 mg/kg)造成記憶損害模型，對照組灌胃生理鹽水，連續14 d[9-10]。

1.6 檢測指標

測量實驗第7天、第14天體質量及大腦指數(Brain Index，BI=大腦質量÷體質量×100%)；第10天和第14天行為學檢測跳臺實驗和避暗實驗的潛伏期，3 min的錯誤次數，消退測驗潛伏期，消退測驗3 min的錯誤次數；大腦尼氏染色(苯胺藍染液)，觀察椎體細胞形態，檢測尼氏體數量(運用Image pro plus 5.1進行形態計量)；ELISA檢測ACh、5-HT、DA、NA、cAMP、cGMP、PKA含量。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 小鼠一般狀態、體質量、腦指數比較

實驗期間，各組小鼠活動正常，毛色正常，造模和用藥后，體質量總體減輕，腦指數增加，但差異均無統計學意義(P>0.05)，氫化可的松、諾麗、人參均不會對體質量和腦指數產生影響，結果見表1。

表1 各組小鼠體質量和腦指數的比較

2.2 小鼠記憶行為學比較

與對照組比較，模型組跳臺測驗和避暗實驗潛伏期顯著縮短(P<0.01)，測驗錯誤次數顯著增加(P<0.01)，說明造模成功。與模型組相比，人參組和諾麗高、中劑量組的潛伏期和消退潛伏期明顯延長(P<0.01，P<0.05)，錯誤次數和消退錯誤次數也明顯減少(P<0.01，P<0.05)。諾麗高劑量組的療效與人參組相近，結果見表2、表3。

表2 小鼠跳臺實驗結果

表3 小鼠避暗實驗結果

2.3 小鼠大腦海馬尼氏體表達情況

對照組小鼠海馬CA3區神經椎體細胞排列緊湊和整齊，尼氏體豐富，且未有明顯的尼氏體深染或固縮。與對照組比較，模型組小鼠海馬CA3區尼氏體數量顯著減少(P<0.01)，細胞排列疏松，且有明顯的椎體細胞深染或固縮。與模型組相比，各給藥組小鼠海馬CA3區尼氏體數量顯著增加(P<0.01)，細胞排列稍緊湊，且椎體細胞深染和固縮減輕。結果見圖1，表4。

圖1 各組小鼠大腦尼氏染色(×10,×100)

表4 100倍光鏡下各組小鼠大腦CA3區尼氏體數量

2.4 小鼠大腦中ACh、5-HT、DA、NA含量比較

與對照組相比，模型組4種神經遞質含量均明顯下降(P<0.01，P<0.05)，與模型組相比,人參組和諾麗高、中劑量組可明顯回升4種神經遞質含量(P<0.01，P<0.05)，結果見表5。

表5 各組小鼠大腦神經遞質含量

2.5 小鼠大腦中cAMP、cGMP、PKA含量比較

與對照組相比，模型組cAMP、cGMP、PKA含量、cAMP/cGMP明顯下降(P<0.01)，與模型組相比,人參組，諾麗高、中、低劑量組均可明顯回升cAMP、cGMP、PKA含量、提升cAMP/cGMP比值(P<0.01，P<0.05)，結果見表6。

表6 小鼠大腦中cAMP、cGMP、PKA含量、

3 討論

隨著社會老齡化的發展趨勢，記憶減退逐漸成為了嚴重的社會和醫學問題，阿爾茲海默病的主要特征是記憶減退。據估計,到2030年，全球將有1.35億人患有阿爾茲海默病[11]。目前仍未發現有效的途徑能從根本上治療記憶減退。對現存改善記憶的中成藥和中藥類保健食品進行數據挖掘和特點分析發現，改善記憶產品用藥多歸腎經[12]。中醫理論認為記憶減退與腎密切相關，腎藏精主骨生髓，腦為髓海，腦為元神之府，腎中精氣虧虛，記憶力下降；腎中精氣充足，腦髓得養，則記憶力增強。GEORGIEVA-KOTETAROVA等[13]在記憶行為學方面觀察到諾麗可改善由地西泮誘導的癡呆大鼠模型，能夠有效防治記憶減退。本實驗重點研究其歸腎經補腎改善記憶的功效和作用機制。

腎精虧耗產生的陰陽氣血失調是衰老和記憶減退的重要原因，當陰陽平衡遭到破壞，人體機能穩態就會發生破壞導致衰老和記憶減退。諾麗性平補腎，平補陰陽，即在腎精虧虛陰陽虛損的情況下，通過既補腎陰又補腎陽調節機體平衡，達到延緩衰老，改善記憶的目的，符合平性藥“條件顯性，雙向適用”的作用特點[14]。氫化可的松致腎陽虛模型是最早建立的中醫模型之一[15]，之后學者相繼用腺嘌呤法、頻繁交配法、甲狀腺切除法模擬腎陽虛，為腎陽虛模型的研究奠定了基礎。沈自尹[16]提出腎陽虛與現代醫學的神經內分泌免疫系統有關，腎陽虛證在下丘腦-垂體-靶腺軸不同環節、不同程度的功能紊亂，在建立腎陽虛證動物模型方面取得了較大突破。氫化可的松為外源性糖皮質激素，當攝入大量外源性糖皮質激素后垂體分泌的促腎上腺皮質激素受到抑制，導致腎上腺皮質激素分泌減少，腎上腺萎縮，使模型動物出現一系列“耗竭”現象，符合中醫腎陽虛證的臨床表現。皋聰等[10]用氫化可的松建立腎陽虛記憶障礙小鼠模型，研究補腎填精對記憶的改善作用。在補腎陽本質的研究中發現，腎陽虛機體免疫功能總體水平低下，cAMP/cGMP比值下降是腎陽虛發病的重要物質基礎，應用藥物使cAMP/cGMP升高，可表示該藥物可補腎陽[17]。依據同類比較原則，陽性藥選擇性溫、大補元氣、歸腎經[18]、有明確改善記憶作用[19]的人參。人參性溫可溫補腎陽，大補元氣，元氣是人體各項生命活動的基礎，是腦部生理功能的根本；元氣充沛，則腦清神明；元氣虧虛，則髓海失養，記憶減退。本實驗模型組cAMP/cGMP降低，用藥后cAMP/cGMP升高，諾麗和人參均表現出補腎陽的趨勢。

PACHAURI等[20]應用東莨菪堿誘導的記憶損傷模型，觀察到諾麗可增加避暗實驗的潛伏時間，增加乙酰膽堿酯酶的活性、提升谷胱甘肽活性、清除丙二醛。本研究避暗實驗及跳臺實驗結果均說明氫化可的松造模后，小鼠存在嚴重的認知障礙。給予人參或諾麗后其記憶行為得到改善，說明人參或諾麗可改善對小鼠的認知能力。諾麗高劑量改善小鼠認知障礙的效果最好，且效果與人參相當。病理觀察小鼠大腦海馬CA3區椎體細胞和尼氏體數量。椎體細胞是參與信息傳遞局部微環路的中間神經元，尼氏體為神經元細胞器合成和更新提供結構蛋白，常作為神經元功能狀態的標志[21]，尼氏體多而大表明神經細胞合成蛋白質的功能較強，突觸為接受信號和傳遞信號的關鍵結構，其形態結構和功能的改變均會影響學習記憶[22]。因此抑制神經元丟失和改善突觸的形態及其功能可能對海馬依賴性學習記憶具有一定的意義。尼氏染色結果說明模型組小鼠存有明顯的神經元丟失和尼氏體損傷。給予人參或諾麗后，椎體細胞深染固縮減輕，表明人參和諾麗可以抑制小鼠神經元丟失。

ACh屬于中樞膽堿能系統，在記憶調節中起著重要作用[23]。5-HT是中樞神經系統中與學習和記憶密切相關的遞質[24]。DA參與學習、記憶和注意力等各種認知過程[25]。NA對記憶的準確性和泛化產生相反的影響，通過對記憶的時間依賴性重組的系統鞏固過程產生不同的影響。NA增強基底外側杏仁核-海馬連通性來提高記憶準確性，從而產生持久的海馬依賴性情節性記憶[26]。造模后，4種神經遞質均明顯減少，而應用人參或諾麗后，神經遞質含量均得到恢復。說明諾麗可以調控記憶損傷情況下的腦內神經遞質。

cAMP作為細胞內傳遞信息的第二信使，主要由腺苷酸環化酶催化三磷酸腺苷而來，容易被細胞內磷酸二酯酶水解。因此，神經細胞內的水平，是由磷酸二酯酶和腺苷酸環化酶二者功能狀態決定的。cAMP的升高可增強突觸前神經遞質的釋放，其作用可能是直接的，也可能是通過激活PKA來實現。研究表明，cAMP/PKA信號通路在蛋白合成依賴性時相中起重要作用，可以經由磷酸化轉錄因子反應元件啟動通路下游基因的轉錄，還能夠磷酸化通道結構亞基而改變其功效，從而調節神經細胞內鈣離子水平和鈣信號轉導。cAMP/PKA信號通路從多個方面改善神經元內在生長狀態影響軸突生長，促進軸突的再生[27]。PKA磷酸化代謝過程中的一些靶蛋白中的絲氨酸或者蘇氨酸殘基，將其激活或活化[28-29]。這些被磷酸化的蛋白是關鍵性的調節酶、功能重要的蛋白質或者轉錄因子，因此可以介導細胞外信號調節的代謝、基因轉錄等細胞的效應。通過對底物蛋白的磷酸化而參與其下游受體的基因表達、突觸功能等的調控、神經活性物質的釋放與合成。神經元和突觸為海馬依賴性學習記憶的生物學基礎[30]，其下游釋放的神經活性物質包括Ach、5-HT、DA、NA等。諾麗可以提升cAMP、PKA含量進而促使腦內神經遞質釋放。

綜上所述，腎生髓通腦，諾麗補腎可改善氫化可的松致腎陽虛的記憶損傷，其機制可通過調節腦內cAMP/PKA通路蛋白，影響下游神經遞質含量，促進神經元蛋白合成而實現。本研究為探討諾麗中藥藥性、指導臨床配伍應用及闡明改善記憶機制提供實驗依據。諾麗的中藥藥性仍有待在實踐中不斷驗證與完善。