梨形環棱螺11個地理種群遺傳多樣性和遺傳分化

金 武，曹靜越，馬 騁，馬學艷，呂國華，聞海波1,,3，顧若波1,,3

(1.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業農村部淡水漁業與種質資源利用重點實驗室，江蘇無錫 214081；2.南京農業大學無錫漁業學院，江蘇無錫 214128；3.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，中美淡水貝類種質資源保護及利用國際聯合實驗室，江蘇無錫214081；4.上海海洋大學，農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室，上海 201306)

梨形環棱螺()是腹足綱(Gastropoda)田螺科(Viviparidae)環棱螺屬()中個體最大的種，該種分布廣、產量大、用途多，是青魚()、寬體金線蛭(Whitman)、中華絨螯蟹()和中華鱉()等水產經濟動物及部分水禽的餌料之一，同時也是廣大居民“菜籃子”的重要組成部分。以中華絨螯蟹需求為例，全國每年平均約需100～150萬噸梨形環棱螺，但2019年全國養殖產量僅為9.289萬噸，市場缺口巨大。對梨形環棱螺的研究集中在形態特征、生長性狀遺傳參數、殼色、水體修復等方面，對梨形環棱螺種群遺傳多樣性和遺傳分化的研究仍較少。

微衛星(microsatellite)即短串聯重復序列(short tandem repeats，STRs)或簡單重復序列(simple sequence repeats，SSR)，它廣泛應用在三角帆蚌()、釘螺(Gredler)、橄欖蟶蚌()等淡水貝類種群遺傳多樣性和群體結構方面的研究。與傳統分子標記相比，它具有分辨率高，可以檢測共顯性遺傳的顯著優點。已有對梨形環棱螺種群遺傳多樣性的研究集中于少數幾個群體，為了進一步對更大范圍內梨形環棱螺遺傳多樣性進行系統背景研究，采用微衛星分子標記分析目前我國梨形環棱螺群體的遺傳資源多態性并篩選最適合養殖和育種的群體，從而為資源實現有序合理開發、開展苗種規模化培育提供支撐。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2021年3-4月，梨形環棱螺樣本采集于山東微山湖(SDWS)、江蘇高郵湖(JSTZ)、上海明珠湖(SHCM)、浙江淳安(ZJCA)、安徽黃陂湖(AHLJ)、湖北長湖(HBQJ)、江西仙女湖(JXYC)、湖南耒水(HNHY)、貴州夜郎湖(GZAS)、廣西千畝湖(GXLZ)、廣東榕江(GDJY)11個不同水域，每個群體30個個體。根據采集時間不同，在貝類養殖系統中暫養至所有群體采集完成。具體采集地點如圖1所示。

圖1 梨形環棱螺采樣點分布圖

1.2 基因組DNA提取、PCR擴增與測序

剪取約50 mg新鮮腹足肌肉，利用動物組織基因組DNA提取試劑盒(上海翼和應用生物技術有限公司)提取DNA。聚合酶鏈式反應總體積為10 μL：模板1.5 μL，Buffer 1 μL，DNA聚合酶0.3 μL，dNTP 0.8 μL，ddHO 5.4 μL，引物1 μL。引物序列來自文獻[20]，上游引物5′端進行熒光修飾，詳細信息如表1所示。PCR擴增程序為：95 ℃ 預變性2 min，94 ℃變性30 s，退火90 s(退火溫度見表1)，72 ℃延伸60 s，共40循環，72 ℃補齊延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物用3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將目的片段送上海翼和應用生物技術有限公司，用ABI Prism 3730 XI測序儀進行毛細管電泳，采用Genemapper V3.0分析各個位點的基因型。

表1 梨形環棱螺7對微衛星引物序列

1.3 數據分析

利用Popgene32軟件分析各個微衛星位點在11個地理種群的等位基因數()、有效等位基因數()、觀測雜合度()、期望雜合度()、Shannon信息指數()，并計算群體間的Nei′s遺傳距離。Hardy-Weinberg平衡偏離指數()按照以下公式計算：

=(-)/

用Cervus 3.2 軟件計算各位點的多態信息含量()。基于群體間的Nei′s遺傳距離用Mega X軟件繪制NJ聚類圖。用Arlequin3.1軟件計算兩兩群體間的遺傳分化指數()，采用分子方差分析(AMOVA)計算群體的遺傳結構，通過1 000次模擬重復抽樣檢驗群體間的顯著性。

2 結果

2.1 微衛星位點的多態性

7對微衛星引物在11個群體中檢測到96個等位基因(表2)，11個群體的介于8～20，為5.882～9.783，平均和為13.714和6.809。其中ATG146位點最多(20個)，CAG41最少(8個)。Shannon信息指數介于1.895～2.614。7個位點的介于0.4～0.8，介于0.844～0.913，7個位點全部偏離Hardy-weinberg平衡(<0)。多態信息含量為0.848～0.980，平均是0.915。7個位點均為高度多態位點(>0.5)。

表2 梨形環棱螺7個微衛星標記的遺傳多態性

2.2 梨形環棱螺11個群體的遺傳多樣性

梨形環棱螺11個群體的遺傳多樣性見表3。11個群體的平均為9.286～20.429，為4.766～11.175。為1.723～2.606。平均和平均分別為0.510～0.535和0.772～0.905。從看，11個群體的均較高(>0.5)，遺傳多樣性均較豐富。

表3 梨形環棱螺11個群體的遺傳多樣性

2.3 遺傳分化

梨形環棱螺11個群體間的Nei′s遺傳相似度和遺傳距離見表4。11個群體間的遺傳距離介于0.143～0.937，Nei′s遺傳相似度介于0.392～0.867之間。HBQJ和JXYC之間遺傳距離最短，GZAS和HNHY之間的遺傳距離最長。基于群體間Nei′s遺傳距離的NJ聚類樹結果如圖2所示。AMOVA分析結果顯示(表5)，11個群體內的遺傳變異占總體變異的94.84%。群體間的遺傳變異占5.16%，11個群體的遺傳分化指數為0.052，說明這11個群體之間遺傳分化較小，且變異的來源主要是各個群體內的個體之間。

表4 梨形環棱螺11個群體的遺傳距離(下三角)和群體間遺傳相似度(上三角)

表5 梨形環棱螺11個群體的AMOVA分析

圖2 基于Nei′s遺傳距離構建的梨形環棱螺11個群體的NJ聚類樹

3 討論

3.1 梨形環棱螺的遺傳多樣性

山東微山湖為南四湖水域的組成之一，本研究中發現SDWS群體的7個位點的平均多態信息含量(=0.845)和文獻[19]中NS群體同樣7個位點的平均多態信息含量(=0.832)無顯著差異。對洞庭湖(DT)、鄱陽湖(PY)、梁子湖(LZ)等8地的梨形環棱螺的遺傳多樣性分析發現平均遺傳多樣性在0.832～0.888之間，且各個種群內部表現出明顯的遺傳變異，但是種群間的遺傳變異差別不大。此外，各個群體顯著偏離Hardy-weinberg平衡，這和本研究中11個地理種群的分析結論一致，且雜合體缺失和無效等位基因的存在是各個群體顯著偏離Hardy-weinberg平衡的原因。截至目前，對全國梨形環棱螺的19個群體進行了遺傳多樣性分析，說明梨形環棱螺種群雖然分布廣，但其遺傳多樣性仍處于較高水平，且不同地理種群之間的遺傳變異不大。長江水系在很長一段時間與兩岸湖泊相互連通，湖泊水系連通性好，以及長江流域頻發的洪水可能促進了長江流域梨形環棱螺的擴散和種群之間的交流。根據BOTSTEIN等提出的衡量基因變異程度高低的指標可見，表明這7個微衛星位點均具有高度多態性，能確切提供遺傳信息，可以應用于梨形環棱螺的遺傳多樣性、遺傳結構、種質鑒定等分析。對銅銹環棱螺的微衛星標記進行種間擴增也表現出較高的多態性，為我國環棱螺遺傳多樣性研究提供依據。

遺傳分化指數是衡量群體間遺傳分化的重要指標，群體間遺傳距離越小，遺傳分化程度越低，群體間的親緣關系越近。一般而言，當<0.05時，群體間遺傳分化較小；0.05<<0.15時群體間有中等程度的遺傳分化；當0.15<<0.25時，群體間遺傳分化程度較大；當>0.25時，群體間遺傳分化顯著。以長江為界，大尺度范圍內對長江以北、長江流域、長江以南三大區域進行AMOVA分析也發現，種群間的遺傳變異比例很低，主要的遺傳變異(91.57%)來自群體內，與本研究結論一致。

3.2 梨形環棱螺繁殖方式

螺類的一些種具有孤雌生殖的繁殖方式，這有利于種群快速擴散，即使只有一個個體也能快速占領特定的生態位并形成種群，孤雌生殖的同一世代個體絕大多數都是雌性個體，少數是雄性個體。梨形環棱螺幼體能夠倒吸在水體表面下進行漂浮，也能吸附在漂浮物上進行水平移動，從而促進了梨形環棱螺的擴散和交流，可能是不同地理種群遺傳多樣性得以保持的原因之一。盡管孤雌生殖會導致群體遺傳多樣性降低，但營孤雌生殖的生物(包括部分螺類)進化出了兩套生殖方式，即有性生殖和孤雌生殖并存，但有性生殖和孤雌生殖在何種條件下進行轉換的機制仍未能得到完全解釋，梨形環棱螺是否也存在類似系統以及這兩套系統在何種條件下進行轉化仍需進一步深入研究。