蔗糖對擬南芥根系偏斜角度的影響

賈容容 楊亞婷 姬新宇 張凈然 田喜元

摘要：本文以野生型擬南芥Col-0及NRT1.1突變體nrt1.1-1和chl1-5為材料，通過在培養基中添加不同濃度的蔗糖，研究了蔗糖對擬南芥根系偏斜程度的影響。結果表明，0，3%蔗糖處理野生型與突變體擬南芥的根系偏斜角度有顯著性差異，突變體根系偏斜角度分別是野生型的1.34-1.80倍（nrt1.1-1）和1.71-2.05倍（chl1-5）。野生型與突變體擬南芥的根系偏斜角度均表現為隨蔗糖濃度的增加而增加，并在2%蔗糖處理達到最高。但3%蔗糖處理時，野生型Col-0根系偏斜角度有顯著性下降，而NRT1.1突變體沒有顯著性變化。該研究為深入研究氮代謝調控碳代謝提供理論依據。

關鍵詞：蔗糖;擬南芥;根系偏斜;NRT1.1

根系是植物生長發育必不可缺的器官，不僅起到固定、支持植物的作用，還能從土壤中吸收植物生長發育必需的水分和養分。植物在生長發育過程中，根系能根據外界環境的變化不斷調整其生長方向以保證其對水分和養分的最佳吸收狀態[1-2]。研究表明，擬南芥在瓊脂培養基上生長時，不同品種擬南芥根系的偏斜程度不同，Columbia 生長有輕微的扭曲，而Landsberg和Wassilewskija有較大的偏斜[3]。此外，瓊脂的濃度也會影響擬南芥根系的傾斜幅度[4]。可見擬南芥根系的傾斜受品種、年齡以及外界環境影響。

前期研究發現，瓊脂培養基上垂直生長的擬南芥根系有嚴重偏離重力方向的傾向，且野生型的傾斜總是向左傾斜的，研究表明，這種生長模式是根與培養基表面的機械接觸和重力共同的作用結果[1，5- 6]。其中，糖類是植物體內重要的碳源和能源，它不僅參與能量代謝，還作為信號分子調控植物的生長發育和生理過程[2]。糖作為植物生長中重要的營養物質，是否會對擬南芥的根系偏斜生長造成影響;根的偏斜程度是否受糖濃度的影響尚不清楚。

另外，外源糖也可以參與對植物中氮同化酶以及離體葉片中硝酸還原酶的表達[7]。而NRT1.1是植物根系吸收硝酸鹽后第一個發揮作用的蛋白，除了參與植物硝酸鹽轉運過程以外，還對植物吸收重金屬產生影響。Wang Wei的研究表明，AtNRT1.1可以通過磷酸化調控其硝酸鹽轉運活性來響應環境中硝酸鹽的波動。這一關鍵發現表明，AtNRT1.1實際上是硝酸鹽傳感的轉環[8]。那么基于外源糖與植物硝酸鹽轉運之間的關系，在擬南芥中，氮的轉運和吸收在外源蔗糖供應下擬南芥的根系偏斜生長中是否存在一定的作用？基于此，本研究以野生型擬南芥Col-0及NRT1.1突變體chl1-5和nrt1.1-1為材料，通過在瓊脂培養基中添加不同濃度的蔗糖，研究了蔗糖對擬南芥根系偏斜程度的影響，并對擬南芥中NRT1.1基因在根系偏斜程度中的作用進行了初步的探索。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物：擬南芥野生型Col-0和擬南芥NRT1.1突變體nrt1.1-1、chl1-5。

供試營養液：改良后MS營養液（具體成分見表1，pH=5.8）。

1.2 植物培養

培養基配制：培養基使用改良后MS配制，向配制好的改良后MS營養液中添加1%瓊脂和1%蔗糖，配制完成后滅菌，再將培養基晾至50℃左右，在超凈臺中向方形培養皿（10cm×10cm）倒入50ml培養基，在超凈臺中晾至培養基凝固（約25min）。

種子滅菌：將種子放入1.5ml離心管中，加入70% 酒精，浸泡1min后加入20 %次氯酸鈉+0.5%吐溫20浸泡10min，使用滅菌水清洗5-6次后，待用。

植物培養：使用槍頭將滅菌后種子點至瓊脂培養基上，20-25粒/排，3-4排/板。直至種子點完，使用封口膜將培養皿邊緣封住。將播種好種子的培養皿放入4℃冰箱中24h后將其轉移至培養箱中培養。培養箱條件：光照/黑暗（16h/8h），溫度（21℃/ 20℃）。培養4天后進行處理。轉移至不同濃度蔗糖的平板，轉移時將根豎直朝下放置，封口膜封口，然后豎立（根朝下）放置至培養箱。培養7天。

1.3 試驗設計

培養基使用改良后MS營養液配制，向配制好的改良后MS營養液中添加1%瓊脂和相應濃度蔗糖，蔗糖含量分別為0，1%，2%，3%。配制完成后滅菌，滅菌將培養基晾至50℃左右后在超凈臺中倒入50ml至方形培養皿中，在超凈臺中晾至培養基凝固（約25min）。將培養4天后擬南芥轉移至不同濃度蔗糖的培養皿中，轉移時將根豎直放置于培養基上，4株/培養皿。轉移結束后，封口膜封口，然后將根豎直朝下放置至培養箱。培養7天后收獲。

1.4 測量指標及方法

收獲培養7天后的擬南芥幼苗，使用全自動根系掃描儀對培養皿進行掃描，用 ImageJ-Evan 測量幼苗根長和傾斜程度;用剪刀剪下主根根尖部分，I2-KI溶液染色，制片后用顯微鏡（x100）觀察根尖中的淀粉粒，并用顯微鏡配置的數碼照相機拍攝根尖;每2株植株作為一個樣品，測量并記錄其生物量。

1.5 數據處理

采用Microsoft Office Excel 2010辦公軟件對試驗數據進行整理，利用SPSS15.0對數據進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度蔗糖對擬南芥根系偏斜方向的影響

擬南芥根系的傾斜是瓊脂表面的依賴行為，培養基中的營養物質可以影響到根系的傾斜。研究表明，無論是野生型Col-0還是NRT1.1突變體，各濃度蔗糖培養基上的根系的根尖均存在向左傾斜的現象。由表2可見，無論是野生型還是突變體擬南芥，根系偏斜角度均表現為隨蔗糖濃度的增加先增加后降低，并在2%蔗糖處理達到最高，野生型Col-0，突變體chl1-5和nrt1.1-1擬南芥根系偏斜角度分別是不添加蔗糖的2.65倍，1.68倍，1.50倍。但是，當蔗糖濃度達到3%時，野生型擬南芥Col-0根系傾斜角度顯著降低，而NRT1.1突變體chl1-5和nrt1.1-1根系傾斜角度與2%蔗糖處理差異不顯著。在0蔗糖處理時，野生型Col-0與NRT1.1突變體擬南芥根系偏斜角度有顯著性差異，NRT1.1突變體擬南芥根系偏斜角度分別是野生型Col-0擬南芥根系偏斜角度的1.34倍（chl1-5），1.71倍（nrt1.1-1）。在1%，2%蔗糖處理時，野生型擬南芥根系偏斜角度比NRT1.1突變體擬南芥根系偏斜角度大，但差異不顯著。在3%蔗糖處理時，野生型Col-0與NRT1.1突變體擬南芥根系偏斜角度存在顯著性差異，突變體ch11-5與突變體nrt1.1擬南芥根系偏斜角度分別是野生型Col-0擬南芥根系偏斜角度的1.80倍，2.05倍。這說明，NRT1.1突變體根系偏斜程度受蔗糖濃度影響程度小于野生型。

2.2 不同濃度蔗糖對擬南芥主根長的影響

由表3可知，無論是野生型還是NRT1.1突變體擬南芥，添加蔗糖均會顯著提高主根長度。添加3%蔗糖處理，野生型Col-0，突變體chl1-5和nrt1.1-1擬南芥主根長分別是不添加蔗糖的1.52倍，1.58倍和1.50倍。另外，對不同濃度下各擬南芥根長與根傾斜角度進行相關性分析發現，野生型和NRT1.1突變體的根長和根系傾斜角度不存在顯著相關關系（P>0.05）。

2.3 不同濃度蔗糖對擬南芥生物量的影響

由表4可知，無論野生型還是NRT1.1突變體擬南芥，添加蔗糖均會顯著提高擬南芥的生物量。添加3%蔗糖處理，野生型Col-0，突變體chl1-5和nrt1.1-1擬南芥生物量分別是不添加蔗糖的2.54倍，2.10倍和2.40倍。NRT1.1突變體生物量受蔗糖濃度影響程度小于野生型。另外，對不同濃度下各擬南芥生物量與根傾斜角度進行相關性分析發現，野生型和NRT1.1突變體的生物量與根系傾斜角度均不存在顯著相關關系。（P>0.05）。

2.4 I2-KI溶液染色結果

目前，對于植物感受重力刺激機制多為淀粉-平衡石假說，該假說認為植物當重力方向發生改變時，平衡石細胞內的淀粉能夠沿重力方向沉降感受重力刺激[11]。因此，根尖的淀粉粒含量直接影響植物根系對重力信號的感受。

由圖1可以看出，NRT1.1突變體與野生型Col-0擬南芥根尖的淀粉粒在0%蔗糖濃度時淀粉含量最少。隨著蔗糖濃度含量的增加淀粉粒的顆粒由小逐漸變大，根尖淀粉粒逐漸增多，但野生型與突變體并沒有明顯差異。

3 討論

前期研究發現，在添加蔗糖的培養基上培養擬南芥時，其根系會出現明顯向左偏斜的行為。那么擬南芥根系的偏斜行為是否受蔗糖濃度的影響？氮的吸收轉運是否參與蔗糖對根系偏斜的影響過程？本研究結果顯示，蔗糖會影響根系生長的偏斜程度，無論是野生型還是突變體擬南芥，根系偏斜角度均表現為隨蔗糖濃度的增加而增加，并在2%蔗糖處理達到最高，當蔗糖濃度達到3%時，野生型擬南芥Col-0根系傾斜角度顯著降低，與不加蔗糖時根系傾斜角度差異不顯著，而NRT1.1突變體chl1-5和nrt1.1-1根系傾斜角度無顯著降低（見表2）。

在0%蔗糖處理時，野生型與突變體擬南芥的根系偏斜角度有顯著性差異，突變體擬南芥根系的偏斜程度比野生型大。氮代謝與碳代謝緊密相連，光合碳代謝為氮代謝提供能量和碳架，氮代謝同碳代謝競爭光反應生成的同化力和中間代謝產物[9]。在低氮情況下進行光合作用的器官氮素降低，氮同化作用減弱，對光合作用的產物的競爭減弱[10]。研究中，NRT1.1突變體因降低了擬南芥根系對氮吸收的轉運過程，因此，與野生型擬南芥相比NRT1.1突變體擬南芥對氮素同化作用減弱，對擬南芥光合作用產生的蔗糖消耗更少。1%-2%蔗糖處理時，野生型擬南芥根系偏斜角度比NRT1.1突變體擬南芥根系偏斜角度大，野生型與突變體擬南芥根系偏斜角度沒有顯著性差異。3%蔗糖處理，野生型與突變體擬南芥的根系偏斜角度有顯著性差異，突變體擬南芥根系的偏斜程度比野生型大。綜上所述，NRT1.1突變體根系偏斜程度受蔗糖濃度影響程度小于野生型，外源蔗糖可通過氮的吸收轉化調控擬南芥根系的偏斜。

根系存在的向左偏斜行為可能是因為通過培養基中增加蔗糖濃度促進其根系生長，導致該現象擴大。但研究中同時對擬南芥生物量、主根長度進行相關性分析發現，與根系傾斜角度并未出現顯著的相關關系。這也可能是因為根尖淀粉粒能影響植物根系對重力的感受[11]，培養基中不同濃度蔗糖影響了根尖細胞淀粉粒的合成或分解，從而使根系偏斜角度增大。對根尖部位的淀粉粒進行染色觀察可以發現，隨著蔗糖濃度的增加，擬南芥根尖中淀粉粒是增加的。淀粉-平衡石假說中認為平衡石細胞中的淀粉體能夠沿著重力方向沉降感受重力刺激，引起植物體內一系列信號分子的改變，使根的生長方向發生改變。當植物受到鹽脅迫時根尖淀粉粒會被分解[11]，降低根尖對重力的感知從而使根系生長方向發生改變。研究發現，培養基中增加蔗糖濃度會使根尖細胞中淀粉粒增加，但野生型與突變體并沒有明顯差異。這表明，外源蔗糖不是完全依靠改變根尖淀粉粒含量來感知重力，除根尖淀粉外，植物體內可能存在多種重力感受機制。

另外，已有研究表明，在根系生長發育過程中，葡萄糖可以通過調節生長素響應途徑影響根系的定向響應。培養基中葡萄糖（Glc）的存在也廣泛地調節了幼苗根系的生長方向[12]。葡萄糖誘導根的傾斜顯著增強。葡萄糖作為糖信號與生長素、乙烯、油菜內酯素等植物激素共同相互作用控制葡萄糖誘導根傾斜[1，13- 14]。故在培養基中添加不同濃度的蔗糖引起擬南芥根系傾斜變化，這可能不僅僅因為蔗糖影響了擬南芥根系中淀粉粒的形成，還可能是通過糖的滲透效應以及糖代謝引起的[10]。蔗糖被根系主動吸收后被降解為葡萄糖和果糖單體，通過葡萄糖含量的增加去調控根系的偏斜程度，但這一猜測還需進行進一步的試驗驗證。

4 結論

1）野生型與突變體擬南芥的根系偏斜角度均表現為隨蔗糖濃度的增加而增加，并在2%蔗糖處理達到最高。

2）NRT1.1突變體根系偏斜程度受蔗糖濃度影響程度小于野生型，外源蔗糖可通過N的吸收轉化調控擬南芥根系的偏斜。

3）不同濃度蔗糖處理下，無論野生型還是NRT1.1突變體擬南芥根系傾斜程度與生物量、根長均無顯著正相關關系。

4）隨著蔗糖濃度含量的增加，擬南芥根尖中淀粉粒逐漸增多。但野生型Col-0與NRT1.1突變體的分布和含量沒有明顯區別，外源蔗糖不是完全依靠改變根尖淀粉粒含量來感知重力。除根尖淀粉外，植物體內可能存在多種重力感受機制。

參考文獻

[1] Roy R，Bassham D C.Root growth movements：waving and skewing[J].Plant Science，2014，42-47.

[2] 李慧敏，梁永書，南文斌，等.糖調控植物根系生長發育的研究進展[J].中國農學通報，2015，31（14）：108-113.

[3] Oliva M，Dunand C.Waving and skewing：how gravity and the surface of growth media affect root development in arabidopsis[J].New Phytologist，2007，176（1）.37-43

[4] Schultz ER，Paul A-L，Ferl RJ.Root growth Patterns and morphometric change based on the growth media[J].Microgravity Science and Technology，2016，28（6）.621-631

[5] 朱蠡慶.力干預擬南芥細胞和根器官生長過程的建模和實驗研究[D].重慶：重慶大學.2017.

[6] Massa GD，Gilroy S.Touch modulates gravity sensing to regulate the growth of primary roots of arabidopsis thaliana[J].The Plant Journal，2003，33（3）.435-445.

[7] 李祎，楊順瑛，郝東利，等.利用gs1.1和gs1.2突變體研究外源蔗糖對高銨脅迫擬南芥碳氮代謝的影響[J].土壤，2021，53（1）：21-29.

[8] Wang Wei，Hu Bin，Li Aifu，et al.NRT1.1 in plants：functions beyond nitrate transporter.[J].Journal of experimental botany，2019.doi：10.1093/jxb/erz554]

[9] 李月芳，于錫宏.外源蔗糖對青花菜體內碳、氮代謝的影響[J].哈爾濱：東北農業大學學報，2007（2）：166-169.

[10] 王雯.不同玉米重組自交系苗期對低氮脅迫的反應及其與蔗糖分配關系的研究[D].太原：山西農業大學，2019.

[11] 武迪，黃林周，高謹，等.植物重力反應的分子調控機制[J].遺傳，2016，38（7）：589-602.

[12] Manjul S，Aditi G，Ashverya L.Glucose control of root growth direction in arabidopsis thaliana.[J].Journal of experimental botany，2014，65（12）.2981-93.

[13] X Y，McCormack M，Li L，et al. Glucose-TOR signalling reprograms the transcriptome and activates meristems.[J].Nature，2013，496（7444）.181-186.