超高效液相色譜－串聯質譜法測定蜂蜜中膽堿和乙酰膽堿

薛 霞，丁 一，公丕學，盧蘭香，王 駿，張艷俠，武傳香，宿書芳，魏莉莉，劉艷明，胡 梅

（山東省食品藥品檢驗研究院 山東省特殊醫學用途配方食品質量控制工程技術研究中心 山東省食品藥品安全檢測工程技術研究中心，山東 濟南 250101）

蜂蜜所含的單糖無需消化即可被人體吸收，對婦、幼特別是老人具有良好的保健作用，因而被稱為“老人的牛奶”［1－2］。近年來，受蜂蜜產量、價格及檢測標準滯后等因素的影響，不少商販采用各種摻假手段生產低質量蜂蜜，甚至假蜂蜜，以賺取高額利潤。摻假蜂蜜極大損害了蜂農、消費者和正規蜂蜜生產企業的利益，嚴重影響了蜂蜜的市場秩序和出口貿易。為提高蜂農的生產積極性，維護蜂蜜市場秩序，促進我國蜂蜜產業的健康發展，建立一套靈敏、高效、準確的蜂蜜內源性成分的分析方法，對蜂蜜摻偽鑒別具有重要意義與價值。

乙酰膽堿是重要的神經遞質，參與調節多種神經功能。膽堿是卵磷脂和鞘磷脂的組成部分，同時又是乙酰膽堿的前體［3－4］。蜂蜜中的乙酰膽堿無需經過體內合成即可直接被人體神經細胞吸收和利用；蜂蜜中大量的膽堿在人體內發生生化反應，還可合成具有生理活性的乙酰膽堿。因此，經常服用蜂蜜可以提高腦內乙酰膽堿的含量，從而促進、激活腦神經傳導功能，提高信息傳遞速度，增強大腦記憶能力。此外，蜂蜜中的乙酰膽堿進入人體后，還可對副交感神經發生作用，促進胃腸蠕動。

關于膽堿和乙酰膽堿含量的測定，報道較多的方法有比色法［5－6］、毛細管電泳法［7］、離子色譜法［8－9］、液相色譜法［10－13］、液相色譜－質譜聯用法［14－20］等。傳統的比色法操作繁瑣、分析時間長，而且前處理易造成樣品損失，選擇性差，干擾因素多。毛細管電泳法的重現性較差。離子色譜法普及性不高、通用性較差；液相色譜法采用的紫外檢測器、電導檢測器或蒸發光散射檢測器均為通用型檢測器，靈敏度不高。液相色譜－質譜法具有分離效率高、靈敏度高、特異性強等優點，已成為復雜基質樣本中痕量或微量目標物的重要檢測手段。乙酰膽堿的測定文獻大多集中在血漿、鼠腦等生物樣本［6，12，18－19］，而膽堿的現有文獻多為嬰幼兒配方乳粉、乳粉和特殊醫學配方食品的研究［5，15－17，20］。目前尚未見蜂蜜中膽堿與乙酰膽堿同時測定的文獻報道。

本文建立了超高效液相色譜－串聯質譜同時測定蜂蜜中膽堿和乙酰膽堿含量的分析方法，方法操作簡單、專屬性好、準確性高，已成功應用于實際蜂蜜樣品中膽堿和乙酰膽堿的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters ACQUITY超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；AB SCIEX Triple Quad 5500三重四極桿質譜分析儀（配有電噴霧電離源ESI，美國SCIEX公司）；3－18K臺式高速離心機（德國Sigma公司）；BT 125D電子天平（德國Sartorius公司）；MS3型旋渦混合器（德國IKA公司）；SB－800DTD超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；Milli－Q超純水系統（美國Millipore公司）；BEH HILIC色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7μm，美國Waters公司）。

氯化膽堿（CAS號：67－48－1，純度97.0%）、氯化乙酰膽堿（CAS號：60－31－1，純度99.7%）標準品，購于上海甄準生物科技有限公司；乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；乙酸銨、乙酸（色譜純，美國Fluka公司）；高氯酸（分析純，天津政成化學制品有限公司）；鹽酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲酸（分析純，天津科密歐化學試劑有限公司）。

1.2 樣品采集

天然成熟蜂蜜均購自當地蜂農，并于4℃冰箱中保存。其它蜂蜜和糖漿購自網購平臺。

1.3 樣品處理

準確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣于25 mL比色管中，加入10 mL水渦旋混勻，超聲15 min，取出恢復至室溫后用乙腈定容至刻度，搖勻。準確移取1.0 mL提取溶液于50 mL容量瓶中，用乙腈－水（體積比8∶2）稀釋并定容至刻度，混合均勻后，經0.22μm微孔濾膜過濾，上機測定。

1.4 色譜－質譜條件

1.4.1色譜條件色譜柱：BEH HILIC（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相：A相為10 mmol/L乙酸銨（含0.1%乙酸）溶液，B相為乙腈；柱溫：40℃；進樣量：2μL，流速：0.35 mL/min。梯度洗脫程序：0～3.5 min（90%～60%B），3.5～4.5 min（60%～40%B），4.5～5.5 min（40%B），5.5～5.6 min（40%～90%B），5.6～8.0 min（90%B）。

1.4.2質譜條件離子源：電噴霧離子源（ESI源）；檢測方式：多反應監測（MRM）；掃描方式：正離子模式掃描；電噴霧電壓：5 500 V；霧化氣壓力：50 psi；氣簾氣壓力：40 psi；輔助氣壓力：50 psi；碰撞氣壓力：8 psi；離子源溫度：550℃。母離子、子離子、去簇電壓、駐留時間及碰撞能量見表1。

表1 乙酰膽堿和膽堿的質譜參數Table 1 MS/MS parameters of acetylcholine and choline

1.5 基質效應評價

分別測定純溶劑與樣品提取液中目標物的峰面積響應值，以二者的相對比值來評價基質效應（Matrix effect）。Matrix effect factor（ME，%）=（A－B）/A×100，其中ME為基質效應因子，A為純溶劑中目標物的峰面積響應值，B為樣品提取液中目標物的峰面積響應值。ME絕對值越大基質效應越強。

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件的優化

膽堿和乙酰膽堿極性較強，在反相色譜柱上保留弱，峰形拖尾嚴重。采用HSS T3和Xbridge C18兩種常用于極性化合物的反相色譜柱進行分析時發現：即使流動相中有機相的比例降為5%，膽堿和乙酰膽堿在兩種反相柱上的保留時間仍不足1 min；文獻［11］采用添加離子對試劑的方法增強膽堿和乙酰膽堿在反相色譜柱上的保留，但離子對試劑與質譜兼容性差，易對質譜造成污染。親水作用色譜（Hydrophilic interaction chromatography，HILIC）能為強極性和強親水性的化合物提供合適的保留，流動相中高比例有機相的使用也有利于提高質譜的離子化效率［21］。本文采用Waters公司ACQUITY UPLCTMBEH HILIC色譜柱進行分離。

在HILIC流動相中，常通過加入緩沖鹽改善化合物的峰形。比較了流動相中不含乙酸銨及含5 mmol/L和10 mmol/L乙酸銨時對目標物分析的影響。結果表明：未加入乙酸銨時，色譜峰分叉；隨著乙酸銨濃度的增加，峰形逐漸變好，但乙酸銨為10 mmol/L時色譜峰前伸依然明顯。在10 mmol/L乙酸銨溶液中加入0.1%（體積分數）乙酸后，膽堿和乙酰膽堿的色譜峰峰形對稱，且響應值明顯提高。因此，最終采用10 mmol/L乙酸銨（含0.1%乙酸）和乙腈作為流動相。

2.2 質譜條件的優化

膽堿和乙酰膽堿的結構中均含有季銨基團，易被電離成正離子。將標準溶液注入超高效液相色譜－串聯質譜儀，在全掃描模式下，獲得化合物的分子離子峰，結合化合物分子式，選擇分子離子峰均為［M+H］+；在產物離子掃描模式下，以各化合物的分子離子峰為母離子，進行二級質譜掃描，獲得碎片離子，選擇兩對豐度較強，基質干擾較小的離子為子離子。在MRM模式下，對去簇電壓、碰撞能等質譜參數進行優化，優化后的質譜條件見表1。

2.3 前處理條件的優化

2.3.1水解必要性考察膽堿是強有機堿性化合物，以游離態膽堿、乙酰膽堿、卵磷脂、鞘磷脂等形式廣泛存在于生物機體中。測定嬰幼兒配方乳粉、乳粉等基質中膽堿時通常采用恒溫水解的方式釋放結合態，測定總膽堿含量［5，15，20，22］。結合文獻，本研究考察了鹽酸水解方法對蜂蜜中膽堿和乙酰膽堿提取效率的影響。以同一個天然成熟的洋槐蜜樣本進行考察。A組樣品按照“1.3”進行處理，B組樣品的制備步驟為：準確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入10 mL 1.0 mol/L HCl渦旋混合均勻后，在70℃下水浴水解3 h，水解后冷卻至室溫，轉移至25 mL比色管或容量瓶中，用水定容至刻度。最后用乙腈－水（體積比8∶2）稀釋50倍，過膜上機測定。每組樣品均平行測定3次。結果發現，A組乙酰膽堿的含量分別為3.86、3.75、3.68 mg/kg；膽堿的含量分別為27.50、28.62、28.49 mg/kg。B組乙酰膽堿的含量分別為0.26、0.31、0.24 mg/kg；膽堿的含量分別為28.75、29.56、29.04 mg/kg。由此可見水解過程中乙酰膽堿損失嚴重，膽堿含量變化不明顯。原因可能是蜂蜜中的膽堿主要以游離態存在，結合態含量很低，且其在酸性條件下熱穩定性較好，因此水解前后含量變化不大。乙酰膽堿是膽堿和乙酸形成的酯，其最穩定的pH值為3.8～4.5［23］，在加熱、強酸性條件下可能發生水解反應，故損失明顯。而實驗所用蜂蜜樣品中乙酰膽堿含量約為膽堿含量的十分之一，即便乙酰膽堿水解產生了部分膽堿，膽堿含量的增加也不顯著。因此，本研究未進行水解反應直接進行測定。

2.3.2提取溶劑的選擇膽堿和乙酰膽堿均易溶于水，蜂蜜中糖含量較高，樣本粘稠，水系溶劑能使樣品均勻分散，更有利于目標物的提取。生物樣本中膽堿和乙酰膽堿的測定常采用高氯酸［10］或乙腈［18］進行蛋白沉淀。本實驗分別考察了0.4 mol/L高氯酸溶液、水－乙腈溶液（體積比2∶3）、0.1%甲酸水－乙腈（體積比2∶3）溶液和純水4種提取溶劑對提取效率的影響。向空白果葡糖漿（F55）基質中加入1.0 mg/kg和10.0 mg/kg的乙酰膽堿和膽堿標準品，分別用上述提取溶劑進行提取，基質匹配標準工作曲線進行定量，計算回收率。結果顯示，用0.4 mol/L高氯酸溶液提取后膽堿的回收率為137%，純水提取后其回收率不足85%，用0.1%甲酸水－乙腈（體積比2∶3）溶液提取后，膽堿的基質效應明顯（23.1%）。綜合以上因素，最終選擇水－乙腈（體積比2∶3）溶液作為提取溶劑，此時膽堿和乙酰膽堿的回收率分別為102%和91.8%。

2.3.3凈化條件的考察為減少蜂蜜中大量的糖類物質對儀器的污染，需對樣本進行凈化。陳舒舒等［24］的研究表明，N-丙基乙二胺固相吸附劑（PSA）可有效吸附蜂蜜中的糖類及有機色素等雜質。本文考察了PSA對蜂蜜中膽堿和乙酰膽堿的凈化效果。蜂蜜用水溶解后，以乙腈定容至刻度，混合均勻，加入固體氯化鈉使乙腈與水分層。移取1 mL乙腈層，加入150 mg無水硫酸鎂，再加入25 mg PSA渦旋混合、離心后過濾，上機測定。結果發現：乙酰膽堿的回收率僅為17.5%，膽堿的回收率為零。這是因為膽堿和乙酰膽堿在水中溶解性好，無法萃取到乙腈層中。

為降低糖分對儀器的污染，采用乙腈－水（體積比8∶2）對糖漿和蜂蜜的提取溶液進行稀釋。發現稀釋倍數為50時，回收率及基質效應均滿足定量要求。

2.4 基質效應評價

進一步對洋槐蜜和果葡糖漿（F55）中2個目標物的基質效應進行考察，結果顯示：水－乙腈（2∶3）作為提取溶劑時，樣品中膽堿和乙酰膽堿的ME均小于10%，基質效應不明顯，滿足定量需求。由于蜂蜜中大都含有膽堿和乙酰膽堿，很難得到空白基質。本方法采用純溶劑標準曲線定量，減少了匹配相同空白基質的難操作性和不同空白樣品匹配的差異性。

2.5 方法學驗證

2.5.1線性關系、檢出限及定量下限將質量濃度分別為0.05、0.1、0.5、1、2.5、5 ng/mL和0.5、1、5、10、25、50 ng/mL的乙酰膽堿和膽堿混合標準工作溶液按“1.4”條件進行測定，以質量濃度（X）為橫坐標，各化合物的定量離子峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線。結果顯示，在0.05～5 ng/mL和0.5～50 ng/mL范圍內，乙酰膽堿和膽堿線性關系良好，線性方程分別為：Y=2.223 04×106X+2 978.314 58和Y=5.776 37×105X+1.777 38×105，相關系數均（r2）大于0.99。以峰高3倍信噪比處對應的濃度作為方法檢出限（LOD）；以峰高10倍信噪比處對應的濃度作為方法定量下限（LOQ）。乙酰膽堿的LOD和LOQ分別為0.05、0.1 mg/kg；膽堿的LOD和LOQ分別為0.5、1.0 mg/kg。果葡糖漿（F55）LOQ水平的加標譜圖見圖1。

圖1 果葡糖漿（F55）中乙酰膽堿（A）和膽堿（B）定量下限加標水平的色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of showing the LOQs for acetylcholine（A）and choline（B）spiked in high fructose syrup（F55）

2.5.2回收率與相對標準偏差在果葡糖漿（F55）樣品中添加一定量的乙酰膽堿和膽堿混合標準溶液，兩者的濃度水平分別為0.1、1、5 mg/kg和1、10、50 mg/kg；洋槐蜂蜜中乙酰膽堿和膽堿的加標濃度水平分別為5、50 mg/kg，平行測定6次，計算方法回收率和相對標準偏差（RSD）。結果見表2。乙酰膽堿和膽堿在糖漿和洋槐蜂蜜中的回收率為97.3%～103%，RSD均不大于5.1%，結果滿足GB/T 27404－2008［25］對回收率和精密度的要求。

表2 乙酰膽堿和膽堿的回收率和相對標準偏差（n=6）Table 2 Recoveries and relative standard deviations of acetylcholine and choline（n=6）

2.6 實際樣品應用

利用本方法對天然成熟的真蜂蜜38批次（洋槐蜂蜜19批次、棗花蜂蜜10批次、荊條蜂蜜9批次），網購的廉價蜂蜜32批次（洋槐蜂蜜12批次、棗花蜂蜜10批次、荊條蜂蜜10批次），果葡糖漿（F55）、果葡糖漿（F42）、甜菜糖漿、大米糖漿等10批次糖漿類樣品進行檢測。結果表明，糖漿中乙酰膽堿和膽堿均未檢出，其余不同種類的天然成熟蜂蜜、網購廉價蜂蜜的檢測結果見表3。洋槐蜜的色譜圖見圖2。

圖2 洋槐蜜樣品中乙酰膽堿（A）和膽堿（B）的色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of acetylcholine（A）and choline（B）in an acacia honey sample

表3 蜂蜜中乙酰膽堿和膽堿的含量（n=3）Table 3 Determination of acetylcholine and choline in honey（n=3）

由表3可知，天然成熟洋槐蜜中膽堿含量明顯高于棗花蜜和荊條蜜，乙酰膽堿含量也高于棗花蜜，與荊條蜜相當。迄今為止，已經證實在30多科50多種高等植物體內存在乙酰膽堿［23］，而乙酰膽堿是膽堿與乙酸形成的酯，因此不同蜂蜜中膽堿與乙酰膽堿的含量差異可能與花的種類及花期有較大聯系。天然成熟蜜中的乙酰膽堿和膽堿含量明顯高于廉價蜂蜜，原因可能與蜂蜜中摻入糖漿有關。

3 結 論

本文建立了超高效液相色譜－串聯質譜同時測定蜂蜜中膽堿和乙酰膽堿的快速分析方法。樣品用水－乙腈（2∶3）提取，適當稀釋后進行測定，方法操作簡單、專屬性好、準確性高。膽堿和乙酰膽堿作為內源性物質，其含量水平可為天然成熟蜂蜜、廉價蜂蜜和糖漿的區分提供幫助。該方法對規范蜂產品市場、保障消費者合法權益以及促進我國蜂產品事業的健康發展具有重要意義。