廣東不同玉米基因型幼胚愈傷組織誘導差異研究

何慧怡 陳勇生 崔方慶 齊永文 勞方業

摘要 [目的]針對廣東玉米品種建立高效遺傳再生技術體系。[方法]以穗甜1號、廣糯1號和廣黑甜3個玉米品種的幼胚為外植體，研究N 6培養基中不同濃度的L-Pro、AgNO 3、2，4-D對愈傷組織誘導率和胚性愈傷率的影響。[結果]較高濃度的Pro（1 000～1 300 mg/L）有利于玉米愈傷組織誘導，而繼代時在N 6培養基中添加29.43 μmol/L AgNO 3則可獲得較多高質量的胚性愈傷組織;對3個玉米品種而言，培養基中2，4-D的適宜濃度為1～2 mg/L。3種基因型的外植體均可誘導出愈傷組織，但基因型和激素種類與濃度均影響愈傷組織誘導效率。[結論]在實際應用中，應根據不同基因型選擇最佳的L-Pro、AgNO 3和2，4-D濃度配比，以獲得較多高質量的胚性愈傷組織。

關鍵詞 玉米;幼胚;愈傷組織;誘

中圖分類號 S513? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）05-0085-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.05.022

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on the Differences of Callus Initiation from Immature Embryos Among Three Varieties of Maize in Guangdong

HE Hui-yi，CHEN Yong-sheng，CUI Fang-qing et al

（Institute of Nanfan & Seed Industry，Guangdong Academy of Sciences，Guangzhou，Guangdong 510316）

Abstract [Objective]To establish high-frequency regeneration technique system for gene tranformation in maize in Guangdong.[Method]The effects of different concentrations of L-Pro，AgNO 3 and 2，4-dichlorophenoxyacetic acid （2，4-D） in N 6 medium on both the callus induction rate and embryogenic callus rate were analyzed with the immature embryos of 3 maize varieties Suitian 1，Guangnuo 1 and Guangheitian used as materials.[Result]The results showed that the percentage of inducing callus was increased evidently with the addition of L-Proline （1 000-1 300 mg/L），and it was optimal for improving the induction percentage of embryogenic callus to add AgNO 3 （29.43 μmol/L） in N 6 medium during subculture;In addition，for 3 tested maize varieties，the most suitable concentration of 2，4-dichlorophenoxyacetic acid （2，4-D） was 1-2 mg/L callus were grown from immature embryos of all the three genetypes，but both genotypes and types and concentrations of phytohormone affcted the frequency of embryogenic callus formation.[Conclusion]In practice，the optimal concentrations of L-Pro，AgNO 3 and 2，4-dichlorophenoxyacetic acid （2，4-D） were necessary to determined for different genotypes in callus induction in order to increase the induction percentage of embryogenic callus.

Key words Maize;Immature emhryos;Callus;Initiation

基金項目 國家現代農業產業技術體系（CARS201707）;國家自然科學基金項目（32072027）;廣東省重點領域研發計劃項目（2019B020238001）;廣東省良種重大科研攻關項目（粵財農2019（73）號）。

作者簡介 何慧怡（1981—），女，廣東廣州人，高級農藝師，碩士，從事生物育種研究。*通信作者，研究員，博士，從事生物育種研究。

收稿日期 2021-05-31

隨著畜牧業的發展和人們生活水平的不斷提高，玉米成為糧食、飼料、經濟兼用的作物，在國民經濟中占有愈來愈重要的地位[1]。其中，玉米組織培養和基因轉化研究一直是國內外的研究熱點之一[2-10]。自1975年Green等[2]利用玉米幼胚作為外植體進行愈傷組織的誘導并成功獲得二倍體再生植株以來，國內科研人員相繼以幼穗[3-4]、花藥[5]、芽頂端分生組織[6]等作為外植體成功獲得植株再生。然而，由于玉米幼胚具有接種方便及易于愈傷組織誘導等優點，因此，幼胚仍是目前玉米組織培養中廣泛使用的外植體類型[4，8-10]。但是，不同基因型玉米幼胚組織培養的效率差異較大[4，11-12]，制約了幼胚在玉米基因工程研究中的應用。為了不斷完善以玉米幼胚為外植體的組織培養技術，使其能更有效地在玉米基因工程上應用，該研究在前人研究的基礎上[4，8-12]，采用L 9（33）正交試驗設計了9種不同誘導培養基對3種不同類型的廣東玉米品種（穗甜1號、廣糯1號和廣黑甜）進行誘導愈傷組織研究，旨在進一步探索建立高效遺傳再生體系的條件，為建立高效的特定玉米品種轉基因受體系統奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料包括3個玉米品種，分別為穗甜1號、廣糯1號和廣黑甜，2018年種植于廣東省科學院生物工程研究所試驗田塊，8月進行人工授粉。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體幼胚的獲取。在開花授粉期對3個品種進行人工套袋，均于授粉后第12天取雌穗剝去外層苞葉，在超凈臺上用75%乙醇浸泡5 min，再用無菌水沖洗3遍，然后用手術刀削去籽粒上端，使幼胚露出，接著用解剖針取出幼胚，盾片向上，接種到誘導培養基上。

1.2.2 愈傷組織誘導和繼代。誘導和繼代培養基是在N 6基礎培養基中添加不同濃度2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、硝酸銀（AgNO 3）和L-脯氨酸（L-Pro），采用3因素3水平正交試驗L 9（33）（表1），每處理接種20皿，每皿20個幼胚。7 d后及時切除胚根和胚芽進行一次繼代培養，14 d后統計愈傷組織誘導率和胚性愈傷率，確定最適宜的配比濃度。

1.2.3 培養條件。誘導培養和繼代培養均為暗培養，溫度為（28±1）℃。

2 結果與分析

2.1 穗甜1號愈傷誘導方差分析

2.1.1 顯著性。由于區組和C因素項的均方與誤差均方差

異不大，所以計算合并誤差均方進行F測驗（當方差分析遇到某變異項的均方與誤差均方相差不大，特別是小于誤差均方時，常將該項平方和與誤差平方和合并相加，其相應的自由度也合并相加，求得合并誤差均方，以提高F測驗的精度[13]）。結果表明，穗甜1號在胚性愈傷率方面，A、B因素各水平間達到極顯著，而在愈傷組織誘導率方面，A、B和C 3因素各水平間都達到顯著或極顯著（表2）。因此，分別對穗甜1號胚性愈傷率和愈傷組織誘導率的顯著因素水平進行多重比較，結果見表3、4。

2.1.2 A、B因素各水平間胚性愈傷率比較。由表3可知，在A因素方面，穗甜1號A 2和A 3處理的胚性愈傷率分別極顯著和顯著高于A 1，而A 2和A 3之間無顯著差異;在B因素方面，穗甜1號B 2處理的胚性愈傷率分別顯著和極顯著高于B 3和B 1，B 3的胚性愈傷率極顯著高于B 1。

從表2方差分析結果中各因素的F值大小可確定穗甜1號在胚性愈傷率方面的因素主次順序為B、A、C;根據多重比較結果（表3）可知，A因素最優水平為A 2，B因素最優水平為B 2，C因素不顯著，其因素水平可任取，故該試驗穗甜1號胚性愈傷率的最優處理組合為A 2B 2C 0，即最優處理組合是1 000 mg/L L-Pro，29.43 μmol/L AgNO 3，2，4-D 3種濃度均可。

2.1.3 A、B、C因素各水平間愈傷組織誘導率比較。由表4可知，在A因素方面，穗甜1號A 3處理的愈傷組織誘導率顯著高于A 1，A 2介于A 1和A 3之間，且與A 1、A 3之間均無顯著差異;在B因素方面，穗甜1號B 2和B 1處理的愈傷組織誘導率分別極顯著和顯著高于B 3，而B 2和B 1之間無顯著差異;在C因素方面，穗甜1號C 2和C 3處理的愈傷組織誘導率均顯著高于C 1，而C 2和C 3之間無顯著差異。

從方差分析結果（表2）中各因素的F值，可確定穗甜1號在愈傷組織誘導率方面的因素主次順序亦為B、A、C;根據表4的多重比較結果可知，A因素最優水平為A 3，B因素最優水平為B 2，C因素較優水平為C 2和C 3，故該試驗穗甜1號在愈傷組織誘導率方面的最優處理組合應為A 3B 2C 2或A 3B 2C 3，即最優處理組合是1 300 mg/L L-Pro，29.43 μmol/L AgNO 3，2或3 mg/L 2，4-D。

2.2 廣糯1號愈傷誘導方差分析

2.2.1 正交試驗結果及顯著性。根據廣糯1號愈傷誘導正交試驗結果進行方差分析，結果見表5。由表5可知，廣糯1號在胚性愈傷率方面，B、C因素各水平間達到極顯著，而在愈傷組織誘導率方面，B因素各水平間達到極顯著。因此，分別對廣糯1號胚性愈傷率和愈傷組織誘導率的顯著因素水平進行多重比較，結果見表6、7。

2.2.2 B、C因素各水平間胚性愈傷率比較。由表6可知，在B因素方面，廣糯1號B 2處理的胚性愈傷率分別顯著和極顯著高于B 3和B 1，B 3的胚性愈傷率極顯著高于B 1;在C因素方面，廣糯1號C 2處理的胚性愈傷率極顯著高于C 3和C 1，C 3和C 1間的胚性愈傷率無顯著差異。

從方差分析結果（表5）中各因素F值大小可確定廣糯1號在胚性愈傷率方面的因素主次順序為B、C、A，其中A因素不顯著，因此其水平可任取。由表6可知，B因素最優水平為B 2，C因素最優水平為C 2，故該試驗廣糯1號在胚性愈傷率方面的最優處理組合應為A 0B 2C 2，即最優處理組合是L-Pro 3種濃度均可，29.43 μmol/L AgNO 3，2 mg/L 2，4-D。

2.2.3 B因素各水平間愈傷組織誘導率比較。由表7可知，在B因素方面，廣糯1號B 1和B 2處理的愈傷組織誘導率間無顯著差異，但均極顯著高于B 3。

從方差分析結果（表5）中各因素F值大小可確定廣糯1號在愈傷組織誘導率方面的因素主次順序為B、C、A;由于A、C因素均不顯著，因素水平均可任取，B因素B 1和B 2水平較優，故廣糯1號在愈傷組織誘導率方面的最優處理組合應為A 0B 1C 0或A 0B 2C 0，即最優處理組合是L-Pro和2，4-D 3種濃度均可，不添加AgNO 3或AgNO 3濃度為2943? μmol/L。

2.3 廣黑甜愈傷誘導方差分析2.3.1 正交試驗結果及顯著性分析。F測驗結果（表8）表明，廣黑甜在胚性愈傷率和愈傷組織誘導率方面，A、B、C 3因素各水平間均達到極顯著差異，因此，分別對廣黑甜胚性愈傷率和愈傷組織誘導率的各因素各水平進行多重比較，結果見表9、10。

2.3.2 各因素水平間胚性愈傷率比較。由表9可知，在A因素方面，廣黑甜A 3處理的胚性愈傷率分別顯著和極顯著高于A 2和A 1， A 2極顯著高于A 1;在B因素方面，廣黑甜B 2和B 3處理的胚性愈傷率均極顯著高于B 1，而B 2和B 3之間無顯著差異;在C因素方面，廣黑甜C 1處理的胚性愈傷率極顯著高于C 2和C 3，而C 2和C 3之間無顯著差異。

由表8方差分析結果中各因素F值大小可確定廣黑甜在胚性愈傷率方面的因素主次順序為A、B、C;根據多重比較結果（表9），A因素較優水平為A 3，B因素較優水平為B 2和B 3，C因素最優水平為C 1，故廣黑甜在胚性愈傷率方面的較優處理組合應為A 3B 2C 1或A 3B 3C 1，即較優處理組合是1 300 mg/L L-Pro，29.43或58.86? μmol/L AgNO 3，1 mg/L 2，4-D。

2.3.3 廣黑甜各因素水平間愈傷組織誘導率比較。

由表10可知，在A因素方面，廣黑甜A 3處理的愈傷組織誘導率極顯著高于A 2和A 1，A 2極顯著高于A 1;在B因素方面，廣黑甜B 1和B 2處理的愈傷組織誘導率均極顯著高于B 3，而B 1和B 2之間無顯著差異;在C因素方面，廣黑甜C 1處理的愈傷組織誘導率分別顯著和極顯著高于C 3和C 2，C 3極顯著高于C 2。

從方差分析結果（表8）中各因素F值大小可確定廣黑甜在愈傷組織誘導率方面的因素主次順序亦為 A、B、C;根據表10的多重比較結果可知，A因素最優水平為A 3，B因素為B 1和B 2，C因素為C 1，故廣黑甜在愈傷組織誘導率方面的最優處理組合應為A 3B 1C 1或A 3B 2C 1，即最優處理組合為1 300 mg/L L-Pro，不添加AgNO 3或29.43? μmol/L AgNO 3，1 mg/L 2，4-D。

3 討論

3.1 培養基中2，4-D、AgNO 3和L-Pro濃度的確定

在一定的濃度范圍內，AgNO 3有利于玉米愈傷組織誘導[14-16]，也證實一些特殊基因型的誘導必須添加AgNO 3 [17]。Songstad等[18]研究認為，植物細胞在體外培養過程中會產生乙烯，在密閉的培養瓶或培養皿中，乙烯積累到較高濃度就會影響到植物細胞的生長發育;而Ag+是一種較好的乙烯活性抑制劑，能通過競爭性結合細胞膜上的乙烯受體蛋白，從而起到阻止或降低乙烯的作用。王漢寧等[19]通過試驗發現，在培養基中添加AgNO 3，可明顯防止褐化現象發生。但也有研究發現AgNO 3在誘導形成愈傷組織的作用方面效果不明顯[20]。

該研究發現，對于甜玉米品種穗甜1號，適當添加AgNO 3（濃度為29.43 μmol/L）有利于其幼胚愈傷組織誘導;而對于糯玉米品種廣糯1號和廣黑甜，在誘導培養基中添加AgNO 3對提高愈傷組織的誘導效果不明顯，但在繼代時添加AgNO 3（濃度為29.43 μmol/L），可獲得較多高質量的胚性愈傷組織。

L-Pro有促進玉米愈傷組織胚性化的作用[21]。付鳳玲等[22]研究認為，培養基中L-Pro濃度對玉米胚性愈傷組織誘導率有顯著影響，在N 6培養基中添加適量L-Pro，可提高胚性愈傷組織誘導率;竇秉德等[20]研究發現，添加了L-Pro的培養基在出愈率和愈傷質量方面均明顯優于未添加的培養基，因此也認為添加L-Pro是必要的。筆者研究發現，對3個參試玉米品種而言，較高濃度L-Pro（濃度為1 000～1 300 mg/L）有利于玉米愈傷組織誘導，這與李金紅等[23]的試驗結果一致。

禾谷類作物組織培養和體細胞胚性誘導過程中，2，4-D的應用十分普遍，主要起脫分化作用[19]。已有研究表明[10，24]，在玉米幼胚培養中，添加2，4-D是誘導愈傷組織形成的關鍵因子，且隨著添加的2，4-D濃度增大，愈傷組織誘導率呈拋物線形變化，當濃度繼續升高時，愈傷組織的誘導率有所下降，因為高濃度的2，4-D易導致體細胞無性系變異[25]。該試驗研究發現，當培養基中2，4-D為1～2 mg/L時，對3個玉米品種的幼胚愈傷組織誘導效果較好，這與上述的研究結果基本一致。

3.2 不同基因型誘導培養基中最佳的2，4-D、AgNO 3和L-Pro濃度配比不同

該試驗的3個參試玉米品種中，穗甜1號為甜玉米品種，其在AgNO 3濃度為29.43 μmol/L、L-Pro濃度為1 300 mg/L、2，4-D為2或3 mg/L時，有利于誘導愈傷組織;而在AgNO 3濃度為29.43 μmol/L、L-Pro濃度為1 000 mg/L、2，4-D 3種濃度均可時，其胚性愈傷率表現好。

廣糯1號為糯玉米品種，其在不添加AgNO 3或濃度為29.43 μmol/L、L-Pro和2，4-D 3種濃度均可時，其愈傷組織誘導率較好;而在AgNO 3濃度為29.43 μmol/L、2，4-D為2 mg/L、L-Pro 3種濃度均可時，其胚性愈傷率較好。

廣黑甜為紫糯玉米品種，不添加AgNO 3或濃度為29.43 μmol/L、L-Pro濃度為1 300 mg/L、2，4-D濃度為1 mg/L時，其愈傷組織誘導率較好;AgNO 3濃度為29.43或58.86 μmol/L、L-Pro濃度為1 300 mg/L、2，4-D濃度為1 mg/L時，其胚性愈傷率較好。

綜上，對于該研究供試的3個不同玉米品種類型，試驗通過幼胚愈傷誘導培養均能誘導出愈傷組織，但基因型和激素種類與濃度均能影響愈傷組織誘導效率，即基因型和培養基中激素的種類與濃度之間存在相互作用，不同基因型間在相同培養條件下或同一基因型在培養基中含不同種類與濃度的激素時，其愈傷誘導率存在差異，因此，不同基因型的培養基中適宜的2，4-D、AgNO 3和L-Pro濃度配比不同，這與以往的研究結果一致[4，11-12]。另一方面，植物組織培養技術是生物工程研究的基礎，是植物遺傳轉化與品種改良研究的基本技術環節之一，而禾谷類作物中玉米作為重要的糧食作物和飼料作物，其組織培養要比水稻、小麥等作物困難[10，26]。因此，有必要對每種特定玉米材料進行大量試驗以確定對應的培養基成分，從而提高愈傷組織誘導效率，獲得高質量的胚性愈傷組織。

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