肝素修飾酶6-O-磺基轉移酶的高產量表達

楊靈康 陳卓 郭盈希

摘要 在化學酶法合成肝素過程中，肝素修飾酶6-O-磺基轉移酶（6-OST）在肝素分子中N-乙酰基葡糖胺的C6羥基上進行硫酸化，以達到與肝素相似的硫酸化水平。構建的重組蛋白MBP-6-OST-3的純化結果表明有較多雜蛋白條帶，且蛋白濃度較低。利用定點突變原理設計引物，通過PCR擴增得到突變質粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His。將突變質粒轉化至大腸桿菌Rosetta-gamiB（DE3），實現了MBP-6-OST-3-His蛋白的表達。利用鎳柱親和層析系統將MBP-6-OST-3-His蛋白純化，并通過SDS-PAGE電泳分析蛋白表達情況。該研究獲得了具有高表達、高純度的MBP-6-OST-3-His蛋白，這為獲得高純度的6-OST-3提供了可靠的方法以及為其應用于化學酶法合成肝素的研究提供了理論基礎。

關鍵詞 肝素;6-O-磺基轉移酶;定點突變;大腸桿菌;蛋白表達

中圖分類號 Q939.9? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2022）05-0081-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.05.021

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

High-yield Expression of Heparin-modifying Enzyme 6-O-sulfotransferase

YANG Ling-kang，CHEN Zhuo，GUO Ying-xi

（School of Food Science and Engineering，Hefei University of Technology，Hefei，Anhui 230009）

Abstract In chemoenzymatic synthesis of heparin，the enzyme 6-O-sulfotransferase （6-OST） sulfated C6 hydroxyl of N-acetylglucosamine to achieve a sulfation level similar to that of heparin.The purification results of the constructed recombinant protein MBP-6-OST-3 showed contaminated protein bands，and the protein concentration was lower.In this paper，the principle of site-directed mutagenesis was used to design primers，and the mutant plasmid pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His was obtained by PCR amplification.The mutant plasmid was transformed into Escherichia coli Rosetta-gamiB （DE3） to express MBP-6-OST-3-His protein.The MBP-6-OST-3-His protein was purified by a nickel column affinity chromatography system，and the protein expression was analyzed by SDS-PAGE electrophoresis.In this study，the MBP-6-OST-3-His protein with high expression and high purity was obtained，which provided a reliable method for obtaining high-purity 6-OST-3 and a certain theoretical basis for its application in the study of chemical enzymatic synthesis of heparin.

Key words Heparin;6-O-sulfotransferase;Site-directed mutagenesis;Escherichia coli;Protein expression

作者簡介 楊靈康（1994—），男，安徽池州人，碩士研究生，研究方向：生物化學。

收稿日期 2021-06-07

肝素是一種線性的、高度硫酸化的糖胺聚糖，由葡萄糖醛酸（主要是艾杜糖醛酸）以1→4糖苷鍵與葡萄糖胺重復二糖單元組成[1-2]。肝素通常是臨床上廣泛使用的凝血抑制劑[3]。肝素廣泛分布于動物細胞表面和細胞外基質中。肝素原料藥可以從包括豬腸和牛肺在內的哺乳動物組織中提取，其中，豬的腸黏膜是肝素生產的最常用來源之一[4-5]。然而，動物源肝素生產供應鏈生產過程長，提取步驟多，易受污染。2008年的肝素鈉污染事件，導致100余名患者因注射了被污染的肝素而死亡，原因是由于肝素摻入了過度硫酸化的硫酸軟骨素[6]。因此，確保肝素安全來源是有意義的，需要建立安全可靠的肝素體外合成方法[7]。

目前，合成非動物來源肝素具有代表性的一種方法是化學酶促法。利用肝素前體多糖作為合成肝素的起始碳骨架，在體外通過N-脫乙酰基酶/N-磺基轉移酶、C5-異構化酶、2-O-磺基轉移酶（2-OST）、6-O-磺基轉移酶（6-OST）和3-O-磺基轉移酶（3-OST）催化，以3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸（PAPS）提供磺基，合成具有活性的肝素[8]。盡管化學酶法生產肝素具有廣闊的前景，但仍存在很多挑戰，其中包括幾種肝素修飾酶的制備[9]。

6-OST是化學酶法合成肝素的一種肝素修飾酶。6-OST將PAPS中的磺基轉移到氨基葡萄糖殘基的6-OH位置以形成6-O-磺基氨基葡萄糖，是化學酶法合成肝素過程中必不可少的步聚[10]。6-OST已成功在大腸桿菌中進行重組表達。Chen等[11]將小鼠6-OST-3（Pro121-Pro450）的催化結構域克隆到載體pMAL-c2X中，并在帶有質粒pGro7的origami-B細胞中表達，該質粒表達大腸桿菌的伴侶蛋白GroEL和GroES，但酶產量小于10 mg/L。因此，作為6種肝素生物合成酶之一，合成高產量的6-OST是用于化學酶法生產生物工程肝素的必要前提。

為獲得高純度的6-OST-3蛋白，該研究通過PCR擴增得到帶有HIS-TAG的突變質粒pMAL-c2X-6OST-3-linker-His，并在大腸桿菌Rosseta-gami B細胞中進行蛋白表達。通過鎳柱親和層析系統進行蛋白純化，獲得了高純度MBP-6-OST-3-His蛋白。該結果為獲得高純度的6-OST-3提供方法，并為后續將其應用于化學酶法合成肝素等研究提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

表達載體pMAL-c2X-6OST-3由合肥工業大學食品與生物工程學院微生物與酶工程實驗室保存;大腸桿菌菌株DH5α、Rosetta-gamiB（DE3）購于Invitrogen公司;PrimeSTAR GxL DNA聚合酶購于TaKaRa公司;SanPrep柱式質粒DNA提取試劑盒、柱式PCR產物純化試劑盒、柱式DNA膠回收試劑盒購于上海普洛麥格生物產品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His的構建與轉化。根據定點突變原理，首先設計1對引物，以pMAL-c2X-6OST-3為模版通過聚合物鏈式反應（PCR）擴增帶有3個His密碼子的突變質粒，上下游引物分別為5′-GGCAGCAGCCATCATCATAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGT-3′和5′-ATGATGATGGCTGCTGCCCATATGCTATGGTCCTTGTTGG-3′，再以突變后的質粒為模板，設計另1對引物，通過PCR反應擴增另外3個His密碼子，上下游引物分別為5′-CATCATCACAGCAGCGGCAAAATCGAAGAAGGTAAACTGGTA-3′和5′-GCCGCTGCTGTGATGATGATGATGATGGCTGCTGCC-3′。因此，經2次PCR擴增后可直接得到突變質粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His，PCR反應使用PrimeSTAR GxL DNA聚合酶，條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 13 min，共16個循環，72 ℃延伸30 min。PCR產物經PCR產物純化試劑盒純化后，進行切膠回收，隨后將PCR產物轉化至DH5α感受態細胞，利用抗性平板（氨芐青霉素）篩選陽性克隆。

1.2.2 pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His驗證。對抗性平板篩選出的陽性克隆進行菌落PCR驗證，PCR驗證引物分別為5′-ATTCAACTTCACCCTCAAGGA-3′及5′-CCAGTGCCAAGCTTTTAGG-3′。反應條件為：95 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，50 ℃ 15 s，72 ℃ 15s，共30個循環，72 ℃延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶大小以進行驗證。選擇條帶大小符合的陽性克隆進行培養，通過質粒提取試劑盒將突變質粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His提取并送樣至通用生物公司進行質粒測序。將測序正確的質粒轉化至Rosetta-gamiB（DE3）感受態細胞，以用于后續蛋白誘導的表達。

1.2.3 MBP-6-OST-3-His蛋白誘導表達。挑取大腸桿菌Rosetta-gamiB（DE3）/pMAL-c2X-6OST-3-linker-His單克隆，加入至含有3 mL LB的培養基中，37 ℃過夜振蕩培養。次日將菌液轉接于2 L LB培養基中，37 ℃振蕩培養約3 h至生長對數期，使得OD 600值約為0.6。再向瓶中加入終濃度為0.2 mmol/L的誘導劑異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），并于22 ℃振蕩培養過夜。

1.2.4 MBP-6-OST-3-His蛋白純化。將2 L過夜培養的細菌培養液進行收集，并于高速離心機中以5 000 g轉速離心15 min，離心后收集細菌沉淀。用60 mL Buffer A（25 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，30 mmol/L Imidazole，pH 7.5）將菌體重懸，并加入終濃度為100 μmol/L的苯甲基磺酰氟（PMSF）。充分混勻后，利用超聲波破碎菌體細胞（工作時間5 s，暫停時間5 s，功率50%，運行時間30 min）。將細胞破碎液收集，于高速離心機中以12 000 r/min的轉速，在4 ℃條件下離心20 min。離心后以收集上清，并通過0.45 μm濾膜過濾以去除雜質。利用鎳親和層析柱進行蛋白純化。用10倍柱體積的Buffer A以1 mL/min的流速充分平衡鎳親和層析柱，將過濾后的粗蛋白溶液以同樣流速上樣后，用Buffer A（25 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，30 mmol/L Imidazole，pH 7.5）洗脫雜蛋白，用Buffer B（25 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，250 mmol/L Imidazole，pH 7.5）洗脫目的蛋白，分管收集洗脫液，通過SDS-PAGE電泳分析目的蛋白。收集濃度較高的蛋白洗脫液，用透析袋（[MWCO]為14 kD）在2 L透析液Buffer C（25 mmol/L Tris，500 mmol/L NaCl，pH 7.5）中進行透析。將透析的蛋白6-OST-3收集于離心管，保存于-80 ℃。通過SDS-PAGE電泳分析目的蛋白，并利用Image J軟件對目的蛋白進行定量。

2 結果與分析

2.1 MBP-6-OST-3蛋白誘導表達

將小鼠6-OST-3（Pro121–Pro450）的催化結構域克隆到載體pMAL-c2X中，并在帶有pGro7質粒的origami-B（DE3）細胞中進行誘導表達，該質粒表達大腸桿菌的伴侶蛋白GroEL和GroES，結果見圖1。圖1中，泳道1為上樣蛋白，泳道2為洗雜時蛋白，泳道3為洗脫目的蛋白。從圖1可見，表達MBP-6-OST-3時，該蛋白雖然可溶性好，但蛋白洗脫后仍有較多雜條帶，且蛋白濃度低，純化后6-OST-3的產量僅為6.1 mg/L，蛋白的產量低。因此，需要對MBP-6OST-3進行改造以提高蛋白濃度和純度。該研究擬在MBP-6OST-3質粒中加入HIS-TAG，并使用鎳柱親和層析對該蛋白進行純化，從而提高蛋白的產量及純化效率。

2.2 pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His的構建

為獲得高表達的6-OST，以質粒pMAL-c2X-6-OST-3為模板，通過2次PCR擴增后，可直接得到突變質粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His。如圖2A所示，由于在PCR擴增中新產生的DNA鏈組成的突變質粒有缺口，因而形成開環質粒，電泳遷移速度較超螺旋質粒更慢[12]。將突變質粒轉化至DH5α感受態細胞后，開環質粒在細胞內缺口發生連接，重新恢復成超螺旋狀態。用瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，結果見圖2B，泳道1為擴增的質粒，可以看到2條帶，分別為8 000 bp及3 000 bp附近，這是由于質粒存在開環和超螺旋2種形態所致。將這2個片段分別進行切膠回收及純化，并分別轉化至DH5α感受態細胞中，通過氨芐青霉素（Ap）抗性平板篩選陽性克隆，利用質粒提取試劑盒提取，并將突變質粒進行送樣測序以進行驗證。

2.3 pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His的驗證

對構建的突變質粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His轉化后，進行菌落PCR驗證，結果見圖3。圖3A為菌落PCR驗證，泳道1、2為DH5α/pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His菌落PCR驗證的結果，DNA片段大小均符合理論值（990 bp）。隨后將這2個陽性克隆進行質粒提取，并送樣測序。由圖3B可見，根據序列比對結果及測序波形圖，可以發現突變質粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His序列中的CATCATCATCATCATCAC為HIS-TAG的堿基序列，可確認測序質粒為正確的突變質粒。

2.4 MBP-6-OST-3-His表達與純化

將DNA測序結果顯示為正確的突變質粒轉化到大腸桿菌Rosetta-gamiB（DE3）表達菌株中，用IPTG于22 ℃條件下誘導過夜。取500 μL誘導前、誘導后的菌液離心，用Buffer A重懸，通過SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達情況，結果見圖4。圖4A中泳道M為蛋白Marker，泳道1為誘導前的蛋白，泳道2為誘導后的蛋白。結果表明，泳道2在81 kD附近有較為明顯的蛋白條帶，這與MBP-6-OST-3-His的蛋白分子量大小一致。為了得到純化的蛋白MBP-6-OST-3-His，利用鎳柱親和層析系統進行蛋白純化，并將目的蛋白濃度較高的蛋白洗脫液進行透析，收集在離心管中，保存于-80 ℃冰箱。對所得透析液進行SDS-PAGE電泳分析，結果見圖4B，泳道M為蛋白Marker，泳道1為純化后的蛋白，只有1條帶，為目的蛋白MBP-6-OST-3-His，且純化效果較好。利用Image J軟件對純化后的目的蛋白MBP-6-OST-3-His進行定量，MBP-6-OST-3-His蛋白濃度為153.8 mg/L，遠高于MBP-6-OST-3純化后蛋白濃度。這說明MBP-6-OST-3質粒加入HIS-TAG后，蛋白純化效率和產量得到了顯著提升。

3 結論

該研究為獲得高產量的6-OST-3蛋白，向MBP-6-OST-3質粒中加入HIS-TAG，從而構建突變質粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His，將突變質粒轉化至大腸桿菌Rosetta-gamiB（DE3）菌株中進行蛋白表達。首先以pMAL-c2X-6OST-3質粒為模板，經2次PCR擴增后得到突變質粒pMAL-c2X-6-OST-3-linker-His。由于突變質粒在擴增后有缺口，從而呈現為開環質粒狀態，區別于從細胞提取的非突變超螺旋質粒。此外，通過PCR擴增，將質粒進行突變，經過切膠回收純化后可直接轉化至DH5α感受態細胞中，這比通過酶切酶連加入外源DNA的傳統方法更加迅速便捷。最后，將突變質粒轉化至宿主大腸桿菌Rosetta-gamiB（DE3）菌株中進行蛋白表達，經過鎳柱純化可以得到高濃度、高純度的MBP-6-OST-3-His。該結果為獲得高純度的6-OST-3提供了可靠方法，以及為后續將其應用于化學酶法合成肝素等研究提供了一定的理論基礎。

參考文獻

[1]

GREEN J V，ORSBORN K I，ZHANG M L，et al.Heparin-binding motifs and biofilm formation by Candida albicans[J].J Infect Dis，2013，208（10）：1695-1704.

[2] LIU J，LINHARDT R J.Chemoenzymatic synthesis of heparan sulfate and heparin[J].Nat Prod Rep，2014，31（12）：1676-1685.

[3] LIU H Y，ZHANG Z Q，LINHARDT R J.Lessons learned from the contamination of heparin[J].Nat Prod Rep，2009，26（3）：313-321.

[4] LINHARDT R J.2003 Claude S.Hudson Award address in carbohydrate chemistry.Heparin：Structure and activity[J].J Med Chem，2003，46（13）：2551-2564.

[5] HAO C，XU H M，YU L F，et al.Heparin：An essential drug for modern medicine[J].Prog Mol Biol Transl Sci，2019，163：1-19.

[6] GUERRINI M，BECCATI D，SHRIVER Z，et al.Oversulfated chondroitin sulfate is a contaminant in heparin associated with adverse clinical events[J].Nat Biotechnol，2008，26（6）：669-675.

[7] WANG T，LIU L，VOGLMEIR J.Chemoenzymatic synthesis of ultralow and low-molecular weight heparins[J].BBA-Proteins Proteom，2020，1868（2）：1-11.

[8] PETERSON S，FRICK A，LIU J.Design of biologically active heparan sulfate and heparin using an enzyme-based approach[J].Nat Prod Rep，2009，26（5）：610-627.

[9] ROY A，MIYAI Y，ROSSI A，et al.Metabolic engineering of non-pathogenic Escherichia coli strains for the controlled production of low molecular weight heparosan and size-specific heparosan oligosaccharides[J/OL].Biochim Biophys Acta Gen Subj，2021，1865（1）[2021-01-17].https：//doi.org/10.1016/j.bbagen.2020.129765

[10] XU Y M，MOON A F，XU S Q，et al.Structure based substrate specificity analysis of heparan sulfate 6-O-sulfotransferases[J].ACS Chem Biol，2017，12（1）：73-82.

[11] CHEN J H，JONES C L，LIU J.Using an enzymatic combinatorial approach to identify anticoagulant heparan sulfate structures[J].Chem Biol，2007，14（9）：986-993.

[12] IROBALIEVA R N，FOGG J M，CATANESE D J，et al.Structural diversity of supercoiled DNA[J].Nat Commun，2015，6（1）：1-11.