富含γ-氨基丁酸的青花菜芽菜酸奶的研制

寇德麟，楊豐偉，吳征宇，劉晴晴，毛碧瑩，謝柯沁，王鴻飛，許 鳳

（寧波大學食品與藥學學院，浙江 寧波 315211）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種天然的非蛋白質的功能性氨基酸[1]，也是一種新型的功能食品因子[2]，許多研究表明，它在降低血壓[3]、誘導放松和增強免疫[4]、改善視覺皮層功能[5]、提高肝臟應激功能、降低癌癥發病率等多個方面[6-7]起到重要的作用，因此研發富含GABA的相關產品是當前研究的重點。植物性來源的GABA因其安全性高而受到廣泛的關注，但大多數植物體內的GABA含量很低，僅為0.3～32.5μmol·g-1[8-9]，因此采用適當的方法使植物體內的GABA得到有效的富集可以拓寬目前GABA的植物性來源。前期研究發現，外源甘露糖處理青花菜芽菜可以通過GABA富集的兩條途徑影響GABA含量，且不影響芽菜本身的功能性物質[10]。

近年來，隨著居民生活水平的提高，人們對食品營養健康方面注重程度提高，酸奶因其豐富的營養價值而受到消費者青睞[11-12]。通過在乳制品中加入適當的功能性物質可以提高其市場競爭力[13-14]。Abdel-Hamid等[15]研發了一種具有抗氧化性和抗菌活性的添加羅漢果提取物的酸奶，付榮霞等[16]也研發了一種具有良好食療效果的山藥薏米芡實褐色酸奶。傳統生產過程中，在酸奶發酵以后加入水果果粒、果蔬汁等添加物，但它們不參與發酵[17]。相關研究發現，在發酵過程中，微生物的代謝作用可以影響果蔬本身的活性物質[18]，例如范媛媛等[19]利用乳酸菌和酵母菌協同發酵發芽糙米來制備GABA。韓梅等[20]雖然也研制了一款富含GABA的酸奶，但其是利用優化后的菌種進行發酵制成的，而通過外源添加富含GABA的青花菜芽菜，同時利用乳酸菌發酵來進一步提升其含量的方法研究較少。

本試驗通過向酸奶中添加青花菜芽菜，并利用發酵技術來制作一種富含GABA的酸奶，通過單因素和響應面試驗研究青花菜芽菜添加量、白砂糖添加量、菌種接種量和發酵時間對酸奶品質的影響，并測定最優條件下制備出的青花菜芽菜酸奶的各項理化指標，為功能性乳制品的研發開拓新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

青花菜種子：品種為炎秀，日本坂田；全脂純牛奶：內蒙古伊利實業集團股份有限公司；葡萄糖：南京甘汁園糖業有限公司；5菌型酸奶發酵劑：北京川秀科技有限公司；白砂糖：太古糖業有限公司；次氯酸鈉、甲醇、氯化鑭、氫氧化鉀、硼砂、四硼酸鈉、苯酚、無水乙醇，均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

DYJ-S6108型種子機：廣東佛山小熊官方旗艦店；AFX-2001-U型超純水機：上海純浦實業有限公司；745型紫外分光光度計：上海美譜達科技有限公司；BPZ11D型分析天平：德國賽多利斯公司；FJL型酸奶發酵機：煙臺凱達電器有限公司；DW-HL528型超低溫冷凍儲存箱：中科美菱低溫科技股份有限公司；RT2122型電磁爐：美的集團；XHF-D型高速分散器（內切式均質機）：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 最適外源糖處理芽菜濃度的篩選

1.2.1.1 青花菜芽菜的培養

挑選完整、飽滿、無病害的種子，用1.5%次氯酸鈉消毒15 min，純凈水沖洗3次，30℃水浴4 h，將種子置于發芽機中。分別配制濃度為0、30、60、90、120、150 mmol·L-1的葡萄糖溶液作為培養液，每天更換培養液。培養8 d后去除芽菜根部取樣，用液氮速凍后置于-80℃冰箱進行后續試驗。

1.2.1.2 GABA的提取

準確稱取0.4 g樣品置于研缽中，加入400μL甲醇研磨，靜置，待甲醇完全揮干后加入2mL 70mmol·L-1氯化鑭，轉移到5 mL離心管中，室溫下振蕩15 min，10000 r·min-1離心15 min。轉移1.6 mL上清液到新離心管中，加入320μL 1 mol·L-1氫氧化鉀，室溫振蕩5 min，上清液即為待測液體。

1.2.1.3 GABA含量的測定

GABA含量測定參考Hu等[21]的方法。取0.2 mL上清液按順序加入0.6 mL 0.2 mol·L-1硼酸緩沖液（pH 9.0）、2 mL 5%苯酚溶液、1 mL 6%次氯酸鈉溶液并分別搖勻，放入沸水浴中加熱5 min，并立即冰浴5 min，溶液出現藍綠色，此時加入2.0 mL 60%酒精終止反應，在645 nm處測定吸光度。分別配制濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g·mL-1的GABA標準溶液，按照上述方式測定相應的吸光度，并以吸光度為縱坐標，相應的GABA質量濃度為橫坐標，繪制GABA含量的標準曲線并擬合標準方程。試驗重復進行3次。

1.2.2 青花菜芽菜酸奶制作工藝流程

青花菜芽菜、全脂純牛奶、白砂糖→調配→均質→滅菌→冷卻→接種→密封發酵→后熟→成品

1.2.3 操作要點

1.2.3.1 青花菜芽菜的處理

按照“1.2.1”的方法，以最適葡萄糖處理濃度培養青花菜芽菜，將芽菜去除根部、挑除種皮后，用無菌紗布包裹，放入沸水中煮1～2 min，瀝干殘余水分。

1.2.3.2 調配、均質

奶瓶使用前沸水浴高溫滅菌，倒置冷卻干燥，加入均質后的青花菜芽菜、純牛奶、白砂糖，適當加熱使白砂糖溶解。

1.2.3.3 滅菌、冷卻

將混合均勻的乳制品在高溫下滅菌處理，迅速蓋上蓋子，保持密封狀態，在室溫下冷卻。

1.2.3.4 接種、發酵

在無菌操作的條件下分別在冷卻的乳制品中接入發酵劑，充分混勻并封口。設置發酵溫度為42℃，發酵后呈凝固狀態的酸奶即為半成品。

1.2.3.5 后熟、成品

將酸奶在4℃條件下冷藏后熟16 h即為成品。

1.2.4 富含GABA酸奶的感官評定細則

邀請15位有一定感官評定基礎的食品學院學生組成感官評定小組，分別從色澤、滋味、組織、氣味4方面對酸奶進行感官評定，評價標準見表1。

表1 富含GABA的青花菜芽菜酸奶感官評價標準Table 1 Reference of sensory score indicatorsof GABA riched broccolisprout yogurt

1.2.5 單因素試驗設計

設置基礎試驗條件為：青花菜芽菜添加量2%，白砂糖添加量7%，菌種接種量0.3%，發酵時間6 h。改變單一因素用量，分別考察不同青花菜芽菜添加量（0、1%、2%、3%、4%）、白砂糖添加量（5%、6%、7%、8%、9%）、菌種接種量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）及發酵時間（4、5、6、7、8 h）對酸奶感官評分的影響，確定各因素的最適范圍。

1.2.6 響應面試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，利用Box-Behnken試驗設計原理，以感官評分為響應值，利用Design-Expert 11.0軟件對試驗數據進行處理，從而確定最優的富含GABA青花菜芽菜的酸奶發酵工藝，試驗因素與水平見表2。

表2 響應面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.2.7 酸奶中GABA含量測定

方法同“1.2.1.3”，將酸奶于10 000 r·min-1條件下離心5 min，取0.2 mL酸奶上清液進行試驗。

1.2.8 理化及微生物指標測定

1.2.8.1 酸度及蛋白質含量

酸度：使用酸度計測定。

蛋白質含量：采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》[22]中的分光光度法測定。

1.2.8.2 微生物指標

乳酸菌：采用GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》[23]中乳酸細菌培養基（MRS）培養基的方法測定。

金黃色葡萄球菌：采用GB 4789.10—2016《食品國家安全標準 食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》[24]中金黃色葡萄球菌平板計數法測定。

1.2.9 數據處理

采用Origin Pro 9.0和SPSS 21.0軟件進行數據處理分析，用鄧肯氏多重比較法進行差異顯著性檢驗，P＜0.05為差異顯著。以上指標均取3個平行樣，重復測定3次。

2 結果與分析

2.1 最適外源糖處理濃度對青花菜芽菜培養中GABA含量的影響

由圖1可以看出，在不同濃度的葡萄糖處理下，青花菜芽菜中的GABA含量呈現下降—上升—下降的趨勢，在處理濃度為120 mmol·L-1時達到最高。因此，選用濃度為120mmol·L-1的葡萄糖培養出來的芽菜GABA富集效果最好。

圖1 不同濃度的葡萄糖處理對GABA含量的影響Fig.1 Effectsof different glucoseconcentrationson GABA contents in yogurt

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 青花菜芽菜添加量對酸奶感官評分的影響

由圖2可以看出，在芽菜添加量為0～2%時，隨著芽菜添加量的增加，酸奶的感官評分隨之升高，正是由于芽菜的加入，使酸奶具有良好的色澤（呈青綠色）且具有芽菜的獨特清香。在芽菜添加量達到2%時，酸奶的色澤與口感都達到最好的平衡；而當芽菜添加量大于2%時，感官評分明顯下降，是因為過多加入芽菜會產生苦澀味，且芽菜氣味過濃掩蓋了酸奶本身的氣味。因此，選擇青花菜芽菜的添加量為1%～3%進行后續響應面試驗。

圖2 不同青花菜芽菜添加量對酸奶感官評分的影響Fig.2 Effects of different broccolisprout additionson sensory scores of yogurt

2.2.2 白砂糖添加量對酸奶感官評分的影響

由圖3可以看出，白砂糖添加量在5%～7%時，感官評分逐漸上升，可能是因為含糖量的上升，甜味更加突出，掩蓋了芽菜本身帶有的苦澀味。而白砂糖添加量大于7%時，產品感官評分顯著降低（P＜0.05），可能是由于含糖量過高，使人產生甜膩感。閆志鵬[25]研制的姜汁酸奶最佳配方中白砂糖的添加量同樣也為7%，而袁云霞等[26]研制的西瓜椰果粒酸奶中雖然白砂糖的最適添加量為6%，但是果粒本身具有一定的甜味，所以適當降低白砂糖添加量可賦予產品更好的口感。因此，選擇白砂糖添加量為6%～8%進行后續響應面試驗。

圖3 不同白砂糖添加量對酸奶感官評分的影響Fig.3 Effectsof different granulated sugar additionson sensory scores of yogurt

2.2.3 菌種接種量對酸奶感官評分的影響

由圖4可以看出，菌種接種量在0.1%～0.3%時，感官得分呈現持續上升的趨勢，當菌種接種量大于0.3%時，產品感官評分變化不明顯，表明此時菌種已經達到飽和，對酸奶的評分影響不明顯。董悅陽等[27]在麻山藥酸奶中的接種量同樣為0.3%，束俊霞等[28]在研究紫薯酸奶時對發酵劑的添加量有不同的結論，這可能是由于菌種種類不同導致。因此，本研究選擇菌種添加量范圍為0.2%～0.4%來進行后續響應面試驗。

圖4 不同菌種接種量對酸奶感官評分的影響Fig.4 Effectsof different lactobacillus additionson sensory scoresof yogurt

2.2.4 發酵時間對酸奶感官評分的影響

由圖5可以看出，發酵時間在4～6 h時，隨著時間的延長，酸奶中的菌群擁有更為充足的時間分解蛋白質，營造更為良好的感官品質。而當發酵時間大于6 h時，感官評分明顯下降，可能是由于菌群大量繁殖，代謝產物大量積聚，使酸奶過酸、產生異味等現象。尹雄等[29]所研制的云南小粒咖啡果皮粉發酵酸奶和屈小媛等[30]研制的黑樹莓酸奶在單因素試驗中采用的最佳發酵時間均為6 h，這與本研究試驗結果一致。因此，酸奶的發酵時間在5～7 h為宜。

圖5 不同發酵時間對酸奶感官評分的影響Fig.5 Effects of different fermentation time on sensory scores of yogurt

2.3 響應面優化結果與分析

在單因素試驗的基礎上，依據Box-Behnken原理，分別以白砂糖添加量（A）、菌種接種量（B）、發酵時間（C）、青花菜芽菜添加量（D）這4個因素作為考察因素，研究各因素間交互作用對富含GABA的青花菜芽菜酸奶品質的影響，響應面試驗結果見表3。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Design and resultsof response surfaceexperiment

通過軟件Design-Expert 11.0對青花菜芽菜酸奶試驗數據進行多元響應面分析，經擬合得到多元回歸模型，表4為回歸模型的方差分析結果。將響應值與各個因素進行回歸擬合，得到回歸方程：

根據表4的回歸模型方差分析可知，該模型P值＜0.000 1，說明回歸模型極顯著，證明該模型較理想，且失擬項P值（0.596 7）＞0.05，不顯著，表明該回歸方程擬合度較高，誤差對試驗結果影響較小。

表4 回歸模型的方差分析Table4 Variance analysisof regression model

從回歸方程系數顯著性檢驗可知，一次項A、C和D對青花菜芽菜酸奶的感官評分影響極顯著（P＜0.01），交互項AB、AD和二次項A2、B2、C2、D2對青花菜芽菜酸奶的感官評分影響均達到極顯著（P＜0.01）水平，BC對青花菜芽菜酸奶的感官評分影響顯著（P＜0.05）。由各因素F值的大小可知，對酸奶感官評分影響程度大小依次為：白砂糖添加量＞青花菜芽菜添加量＞發酵時間＞菌種接種量。通過對方程的手動優化，去除不顯著的B、AC、BD和CD項后，得到優化后的方程為：Y=97.66+1.48A+1.38C+1.39D+2.63AB+4.19AD-2.02BC-7.91A2-2.28B2-3.83C2-8.84D2，優化后的方程能夠很好地擬合真實值。

續表4 回歸模型的方差分析Continue table4 Variance analysisof regression model

根據Design-Expert 11軟件得到的響應曲面圖和等高線圖可以直觀地表示響應值與因素水平之間的關系[31]。由圖6可知，6個響應面圖都是開口向下的，說明酸奶感官評分在試驗設計的范圍內存在最大值。通過軟件可以預測出青花菜芽菜酸奶的理論最佳制作工藝條件為：白砂糖添加量7.1%，菌種接種量0.29%，發酵時間6.19 h，青花菜芽菜添加量2.1%，此時酸奶的感官評分最高，為97.95分。

圖6 各因素交互作用對酸奶感官評分影響的響應面圖和等高線圖Fig.6 Responsesurfacediagramsand contour mapsshowinginteraction effectsof variousfactorson sensory scoresof yogurt

2.4 驗證試驗

為了方便進行試驗操作，將響應面預測的最優工藝進行一定的修正，即：白砂糖添加量7.1%，菌種接種量0.3%，發酵時間6.2 h，青花菜芽菜添加量2.1%。在該工藝條件下，分別進行3次驗證試驗，測得酸奶感官評分平均值為98.5分，與響應面預測結果無顯著性差異，說明本試驗中得到的青花菜芽菜酸奶的制作工藝可靠。

2.5 酸奶產品中GABA含量檢測結果

在上述最佳工藝條件下測得的酸奶GABA含量達0.789 g·L-1，而未添加青花菜芽菜的酸奶中GABA含量為0.245 g·L-1，說明通過添加青花菜芽菜發酵酸奶能使GABA含量有明顯提高。

2.6 酸奶產品理化及微生物指標檢測結果

經檢測，酸奶產品酸度值為41°T，蛋白質含量為30.25 g·L-1，乳酸菌數量為1.5×108CFU·mL-1，未檢出金黃色葡萄球菌，符合國家乳制品要求。

3 結論

在酸奶中加入葡萄糖處理后的青花菜芽菜共同發酵，制成富含GABA的酸奶，既符合當代人的健康需求，也起到了良好的保健功效，同時，酸奶中添加適量的青花菜芽菜，不僅可賦予酸奶清新的口感，還可讓人在視覺上有更舒服的感受，具有很高的商業價值。經過單因素試驗及響應面優化得到酸奶制作最佳工藝參數為：白砂糖添加量7.1%，青花菜芽菜添加量2.1%（采用120 mmol·L-1葡萄糖溶液培養青花菜芽菜），菌種接種量0.3%，發酵時間6.2 h。在此工藝條件下，酸奶中的GABA有明顯的富集，達到0.789 g·L-1，且理化指標和微生物指標均符合國家標準。