高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測中藥軟膏劑中9 種糖皮質激素

杜遠東，穆思芊，丁 偉，趙重博

（1.陜西省漢中市食品藥品監督檢驗檢測中心，陜西 漢中 723000； 2.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046）

近年來，中成藥或保健食品中檢測出非法添加化學藥的現象時有發生，特別是中藥軟膏制劑中非法添加糖皮質激素類藥物的現象突出。糖皮質激素是由腎上腺皮質分泌的一類甾體類化合物，與糖、脂肪、蛋白質的代謝和生長發育密切相關，具有抗感染、抗過敏、抑制免疫反應等多種藥理學作用［1］，臨床主要用于治療腎上腺皮質功能紊亂，自身免疫性疾病如腎病型慢性腎炎、系統性紅斑狼瘡、類風濕關節炎，變態反應性疾病如支氣管哮喘、感染性疾病、休克，器官移植的排異反應，眼科疾病［2］，尤其適用于皮膚炎癥，長期使用會產生瘢痕、皮炎、感染等嚴重副作用，危害人體健康［3］。常用于檢測中成藥中非法添加化學藥物的方法有物理化學鑒別法、薄層色譜法、高效液相色譜法、液質聯用法、紅外光譜法、拉曼光譜法等［4-9］，目前主要采用高效液相色譜法和液質聯用法［10-12］檢測食品、藥品、化妝品中糖皮質激素等非法添加成分。由于中藥軟膏劑基質復雜，已有藥品中糖皮質激素的檢測方法難以對其進行準確、快速篩查。本研究中建立了適用于日常監督檢查中快速檢測中藥軟膏制劑中氫化可的松、曲安奈德、氟輕松、曲安奈德醋酸酯、氟輕松醋酸酯、倍他米松戊酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松雙丙酸酯、倍氯米松雙丙酸酯9 種糖皮質激素的高效液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC - 20AT 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；API 3200 型三重四極桿質譜儀，配有Analyst1.6 工作站，電噴霧離子源（ESI，美國AB 公司）；BT 261 型電子分析天平（瑞士梅特勒公司，精度為十萬分之一）；Nexpower 1000 型純化水儀（韓國Human 公司）；Transferpette 型可調移液器（德國Brand 公司）；KQ - 250DE型數控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；TG16-WS型離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；MX -E 型渦旋儀（大龍興創實驗儀器＜北京＞有限公司）。

1.2 試藥

甲醇、乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；甲酸（色譜純，成都科龍化工試劑廠）；水為實驗室自制一級水。氫化可的松對照品（批號為100152 - 201707，純度為99.2%），曲安奈德對照品（批號為100055 -201804，純度為98.8%），曲安奈德醋酸酯對照品（批號為100125 - 201406，純度為99.1%），氟輕松醋酸酯對照品（批號為100010-201108，純度為99.6%），倍他米松戊酸酯對照品（批號為510017 - 201301，純度為99.5%），氯倍他索丙酸酯對照品（批號為100302 -201804，純度為99.2%），倍他米松雙丙酸酯對照品（批號為100596 - 201902，純度為99.2%），倍氯米松雙丙酸酯對照品（批號為100119-201805，純度為98.8%），均購于中國食品藥品檢定研究院；氟輕松對照品（邁迪嘉＜天津＞科技有限公司，批號為ALT600756，純度為98.1%）。中藥軟膏樣品信息見表1。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件

色 譜 柱：Shimadzu Shim - pack VP - ODS C18柱（150 mm × 2.1 mm，3 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）- 乙腈（B），梯度洗脫（0～2 min 時5%B →55%B，2～6 min 時55%B →85%B，6～7 min 時85%B →5%B，7～10 min 時5%B）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5μL。

2.1.2 質譜條件

離子源：ESI，多重反應監測，正離子掃描；離子化電壓：5 500 V；溫度：550 ℃；氣簾氣：30 psi；噴霧氣：50 psi；輔助加熱氣：55 psi；碰撞氣：氮氣；碰撞池入口電壓：10 V；碰撞池出口電壓：3 V。被測組分相關質譜參數見表2。

表2 9種糖皮質激素的相關質譜參數Tab.2 LC-MS/MS parameters of nine glucocorticoids

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：分別取氫化可的松、曲安奈德、氟輕松、曲安奈德醋酸酯、氟輕松醋酸酯、倍他米松戊酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松雙丙酸酯、倍氯米松雙丙酸酯對照品各10 mg，精密稱定，分別置25 mL棕色容量瓶中，加乙腈溶解并定容，搖勻，制成質量濃度為400 μg/ mL 的對照品貯備液；分別精密量取各對照品貯備液適量，加乙腈稀釋成質量濃度為50μg/mL 的混合對照品溶液。

供試品溶液：取混合均勻的樣品0.2 g，精密稱定，置10 mL 具塞比色管中，加入飽和氯化鈉溶液1 mL，渦旋30 s，再加入乙腈2 mL，渦旋30 s，加入乙腈近刻度，超聲提取30 min，冷卻至室溫，加入乙腈定容，搖勻，以4 000 r/min 的轉速離心10 min，取上清液，0.22μm 濾膜濾過，取續濾液，即得。

基質標準曲線溶液：取上述混合對照品溶液，逐級稀釋成質量濃度為20.0，10.0，4.0，2.0，0.5，0.2μg/mL的系列標準溶液。將不含9種待測激素組分且基質組成與供試品相近的樣品作為空白樣品，取6 份，各0.2 g，精密稱定，分別置10 mL 比色管中。分別加入上述系列標準溶液0.1 mL［13-14］，按供試品溶液制備方法制成氫化可的松、曲安奈德、氟輕松、曲安奈德醋酸酯、氟輕松醋酸酯、倍他米松戊酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松雙丙酸酯、倍氯米松雙丙酸酯質量濃度分別為2，5，20，40，100，200 ng/mL系列基質標準曲線溶液。

陰性樣品溶液：取不含9 種待測激素組分的樣品，按供試品溶液制備方法制備溶液，即得。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2項下混合對照品溶液和陰性樣品溶液各適量，按2.1 項下色譜與質譜條件進樣分析，記錄多重反應監測色譜圖。結果陰性樣品溶液色譜中在對照品溶液色譜出峰時間處無相應吸收峰，提示其他成分對其測定無干擾。詳見圖1。

線性關系考察、定量限與檢測限確定：取2.2項下系列基質標準曲線溶液，按2.1項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積積分值，以各組分質量濃度（X，ng/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表3。取2.2 項下系列基質標準曲線溶液，逐級稀釋，按2.1 項下色譜與質譜條件進樣分析，當信噪比（S/N）為10∶1 時，得各化合物的定量限；當S/N為3∶1 時，得各化合物的檢測限。結果見表3。

表3 9種糖皮質激素的線性關系考察結果、檢測限與定量限、加樣回收試驗結果Tab.3 Results of the linear relation test，LOD，LOQ and the recovery test of nine glucocorticoids

精密度試驗：取2.2 項下系列基質標準曲線溶液，按2.1 項下色譜與質譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果氫化可的松、曲安奈德、氟輕松、曲安奈德醋酸酯、氟輕松醋酸酯、倍他米松戊酸酯、氯倍他索丙酸酯、倍他米松雙丙酸酯、倍氯米松雙丙酸酯峰面積的RSD分別為3.13%，4.47%，4.07%，3.56%，4.24%，3.96%，3.05%，3.66%，3.61%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取2.2 項下陰性樣品溶液6 份，分別精密加入等量2.2項下對照品貯備液，使各激素含量均為0.2 mg/g，按2.2 項下方法制備6 份供試品溶液，按2.1 項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄6 份供試品溶液中9種激素含量。結果各激素含量的RSD均小于10%（n=6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗［15］：取重復性試驗項下的供試品溶液1份，置室溫下避光保存，分別于0，2，4，6，8，12 h時按2.1項下色譜與質譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果各激素峰面積的RSD均小于8%（n=6），表明供試品溶液在室溫下12 h內穩定性良好。

加樣回收試驗［15］：取2.2 項下混合對照品溶液，用乙腈稀釋10倍，得質量濃度為5μg/mL的溶液；取陰性樣品0.2 g，精密稱定，共18 份，按低、中、高濃度水平分別加入上述混合對照品溶液10，80，400μL，平行3 份。按供試品溶液制備方法制備加標供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算含量和加樣回收率。結果見表3。

2.4 樣品含量測定

取8 批樣品，依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜與質譜條件進樣測定，采用外標法計算樣品中各組分的含量。結果僅1 批樣品檢出氯倍他索丙酸酯，含量為8.35μg/g。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法優化

曾考察渦旋振搖和超聲提取方法，以及不同提取時間（10，20，30，40 min），結果超聲提取的回收率高于渦旋振搖提取，且超聲提取30 min 的回收率趨于穩定。曾考察離心過濾和固相萃取2 種方法用于溶液凈化，結果離心過濾的回收率高于固相萃取，且簡便易行。

3.2 色譜條件優化

考察了C18柱（150 mm × 2.1 mm，3 μm）和C18柱（150 mm × 2.1 mm，5 μm）對測定結果的影響，結果3 μm 粒徑C18柱的分離度和峰形均優于5 μm 粒徑C18柱。流動相的有機相考察了乙腈和甲醇，乙腈的分離效果和洗脫能力均優于甲醇，水相考察了水、0.1%甲酸水溶液和0.1%乙酸水溶液，0.1%甲酸水溶液的色譜峰強度高于水和0.1%乙酸水溶液。采用梯度洗脫有助于化合物的快速洗脫，減少色譜峰的拖尾現象，且在流動相中加入少量乙酸有利于化合物的離子化，可提高靈敏度。

3.3 方法評價

建立的LC - MS/MS 法靈敏度高、專屬性強、重復性好，可用于同時檢測中成藥軟膏劑中非法添加的糖皮質激素類化學成分。