腎寶片需氧菌總數(shù)測量不確定度評定

張莉敏，李默耕，王曉梅

（1.山東省棗莊市食品藥品檢驗檢測中心，山東 棗莊 277000； 2.山東省棗莊市山亭區(qū)疾病預防控制中心，山東 棗莊 277200； 3.山東省棗莊市市場監(jiān)管綜合服務中心，山東 棗莊 277000）

需氧菌總數(shù)的測量結果可反映藥品在生產(chǎn)加工、包裝、運輸?shù)拳h(huán)節(jié)的質量控制情況［1］，是評價某產(chǎn)品是否被微生物污染的指標。不確定度是指由于存在不可避免的誤差，對被測量值不能肯定的程度。不確定度越小，測量值與被測量的真實值越接近［2］。腎寶片具有調和陰陽、溫陽補腎、扶正固本功效，本研究中評定了其需氧菌總數(shù)的測量不確定度，以促進合理用藥。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

儀器：PGL3002 型電子天平（艾德姆衡器＜武漢＞有限公司，精度為0.1 g）；DHP9082 型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；GR60DF 型立式壓力滅菌器（致微＜廈門＞儀器有限公司）；量筒（規(guī)格為100 mL），分度吸量管（規(guī)格為1 mL），均購自天津市天科玻璃儀器制造有限公司。所用儀器及量具均在檢定有效期內。

試藥：腎寶片（山東幸福人醫(yī)藥連鎖有限公司，批號為2012604）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號為200709），氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號為190728，pH 7.0），均購自北京陸橋技術股份有限公司；純化水（山東省棗莊市食品藥品檢驗檢測中心自制）。培養(yǎng)基及純化水經(jīng)適應性檢查，腎寶片需氧菌計數(shù)方法經(jīng)微生物檢驗方法學驗證，均符合要求。

1.2 溶液制備

取樣品10 g，精密稱定，共20 份（編號為1～20），置勻漿罐中，加氯化鈉- 蛋白胨緩沖液100 mL，均質溶解，混勻成1∶10（m/V）的供試品溶液，取1 mL 沿管壁緩慢加入含有9 mL氯化鈉-蛋白胨緩沖液的無菌試管中，旋渦混勻，制成1∶100（m/V）的稀釋液。

1.3 計算方法

參照2020 年版《中國藥典（四部）》［3］160-165通則1105 項下方法測量樣品中的需氧菌總數(shù)。取1∶10 和1∶100（m/V）的稀釋液各1 mL，分別加入無菌培養(yǎng)皿中；同時，取1 mL氯化鈉-蛋白胨緩沖液加入另一無菌培養(yǎng)皿中，作為陰性對照。各培養(yǎng)皿中分別加入20 mL胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，混勻，瓊脂凝固后，置（33±1）℃條件下培養(yǎng)5 d，計數(shù)。所有步驟均由同一檢測人員操作。

1.4 數(shù)學模型建立

建立數(shù)學模型［4］Y=f（X1，X2…Xn） =KX/（mV）。其中，Y為單位質量樣品的需氧菌總數(shù)（cfu/g）；K為樣品稀釋后的體積（mL）；X為某稀釋級下n個培養(yǎng)皿的平均菌落數(shù)（cfu）；m為取樣量（g）；V為該稀釋級下取樣體積（mL），一般為1 mL。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源

依據(jù)本次試驗測定的過程和數(shù)學模型分析，腎寶片需氧菌總數(shù)的測量不確定度來源主要有樣品重復性檢測、玻璃量器、加樣體積、天平稱量。

2.2 不確定度分量評定

2.2.1 樣品重復性檢測

檢測完成后，根據(jù)菌數(shù)報告規(guī)則，選取平均菌落數(shù)小于300 cfu 的稀釋級為檢測報告的依據(jù)［3］160-165，由于1∶10和1∶100（m/V）的稀釋液均滿足上述要求，故選取含菌落數(shù)最多的、稀釋級為1∶10（m/V）的稀釋液為菌數(shù)結果報告（見表1）。按1.3 項下方法計數(shù)，得X1和X2。陰性對照皿中菌落數(shù)均為0。

表1 樣品重復性檢測結果Tab.1 Results of the repeatability test of samples

依據(jù)殘差平方和公式，利用表中的數(shù)據(jù)，計算20份樣品的殘差平方和依據(jù)貝 塞 爾 公 式 計 算 標 準 差（S） ，S=其中，a為樣品份數(shù)，b為每份樣品的測量次數(shù)，代入數(shù)據(jù)得S=

因每個樣品測量2 次，則標準不確定度［U（Y）］=相對標準不確定度

2.2.2 玻璃量器

20 ℃時，規(guī)格為100 mL 的量筒和規(guī)格為1 mL 的分度吸量管的容量允差分別為±1.0 mL和±0.008 mL［5］，但缺乏置信水平，標準不確定度是假設校準引起的，呈矩形分布［6］。計算100 mL 量筒和1 mL 的分度吸量管引入的標準不確定度相對標準不確定度分別為Urel（100 mL）= 0.577 4/ 100 =0.005 8，Urel（1 mL）=0.004 6/1=0.004 6。

2.2.3 天平稱量

電子天平的允許誤差為± 0.1 g［7］。先稱定空盤的質量，再稱定空盤和樣品的總質量，2 次稱量均獨立完成，二者為非線性相關關系，天平最大允許誤差為矩形分布，故需計算2 次不確定度［8］，標準不確定度（Um）=實際稱取樣品量（m）為10.00 g，相對標準不確定度［Urel（m）］=Um/m=0.081 6/10.00=0.008 2。

2.2.4 加樣體積

1∶10（m/V）稀釋過程引入的不確定度與2.2 項下玻璃量器項下的相對標準不確定度相同，Urel（V100mL）=0.005 8，Urel（V1mL）=0.004 6。

2.2.5 合成不確定度

各分量引入的相對標準不確定度互不相關，故需計算合成相對標準不確定度［Urel合（Y）］。

計算標準不確定度［U合（Y）］。U合（Y）=Urel合（Y）×

按照《中華人民共和國國家標準》（GB/ T 27418A2017）的t分布表［置信概率（P）= 95%，自由度（v）= 20］［2］，可查包含因子（K）為2.09，計算擴展不確定度（U），即U合=U合（Y）×K= 0.049 9 × 2.09 =0.104 3。

2.3 不確定度結果

由表1 可知，腎寶片需氧菌總數(shù)的檢測結果表示為2.168 3±0.104 3，K為2.09，取反對數(shù)，最終腎寶片需氧菌總數(shù)菌落報告總數(shù)為330～530 cfu/g。

3 討論

分析腎寶片需氧菌總數(shù)測定的不確定度分量發(fā)現(xiàn)，樣品重復性檢測引入的不確定度分量最大，天平稱量、玻璃量器、加樣體積引入的不確定度分量較小。在樣品重復性檢測中，檢測數(shù)據(jù)的差異受眾多因素影響，如微生物的活體易變及分布不均勻、生態(tài)環(huán)境多樣復雜、檢驗方法存在誤差等［3］388，但主要因素為微生物在樣品中分布不均勻，故腎寶片需氧菌總數(shù)測定的不確定度評定主要誤差來源于微生物分布的不均勻。腎寶片需氧菌總數(shù)測量不確定度的評定中，培養(yǎng)基的質量、檢驗室環(huán)境潔凈度、培養(yǎng)溫度變化等分量引入的不確定度不能直接測量或以統(tǒng)計學方式進行評定［9］，后續(xù)研究將考慮這些因素造成的結果偏離，以降低由此引入的不確定度，促使需氧菌總數(shù)測定結果更準確。

但由于微生物檢驗的特殊性及難以定量的特性，測量不確定度在該領域的運用較緩慢［10］。近年來，食品微生物領域多見測量不確定度評定的文獻報道［11］，藥品微生物相關文獻報道較少［12］。目前，國家已發(fā)布相關標準對測量不確定度評定有了明確要求。《檢測和校準實驗室能力的通用要求》中規(guī)定，開展檢測的實驗室應評定測量不確定度；當檢測結果需要或客戶有要求時，檢測報告應帶有與被需求單位要求的測量不確定度［13］。《測量不確定度的要求》（CNAS-CL07）中規(guī)定，檢測實驗室應有能力對每項有數(shù)值要求的測量結果進行測量不確定度評估［14-15］。各級食品藥品檢驗機構對外出具的檢測數(shù)據(jù)是反映樣品質量是否合格的重要依據(jù)，同時反映了實驗室風險控制和質量控制的情況。故引入測量不確定度對評估定量分析方法的可靠性和測量結果的準確性意義較大。