高效液相色譜法同時測定麻黃-桂枝藥對中7 種成分含量

王東海，湯建華，楊曉媛，于小緯

（河北北方學院附屬第一醫院，河北 張家口 075000）

麻黃- 桂枝藥對在麻黃湯、大青龍湯等經典方劑中都有應用，是中醫臨床常用藥對。麻黃主要有效成分為鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸甲基麻黃堿等［1］，具有鎮咳平喘、發汗等作用［2］。桂枝主要有效成分為桂皮醛、桂皮醇、桂皮酸、香豆素等［3］，具有解熱、鎮痛、鎮靜等作用［4］。麻黃湯中麻黃與桂枝的配伍比例為3∶2，即麻黃用量150 g，桂枝用量100 g，為治療外感風寒表實證的名方。麻黃發表散寒，配伍辛溫之桂枝，解肌祛風，兩藥相須為用，增強發汗、解表、散寒之功效［5］。本研究中按麻黃和桂枝配伍比例3∶2 制備藥對，參考文獻［6-10］，建立了同時測定麻黃-桂枝藥對提取物中麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿、桂皮酸、桂皮醇、桂皮醛和香豆素7種成分含量的高效液相色譜切換波長法，以評價麻黃-桂枝藥對提取物的質量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 型高效液相色譜儀（美國Waters 公司），配有2998 型二極管陣列檢測器和2695 Alliance 型四元梯度泵；MSE 6.6S - 0CE - DM 型電子天平（賽多利斯科學儀器＜北京＞有限公司，精度為0.001 mg）；AUW120D 220D 型電子分析天平（日本島津公司，精度為0.01 mg）；D115 型烘箱（德國Binder 公司）；KQ -500B 型超聲波清洗儀（鄭州寶晶電子科技有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；XJA - 1A 型萬能粉碎機（江蘇姜堰市銀河實驗儀器廠）。

1.2 試藥

鹽酸麻黃堿對照品（批號為171241 - 201809），鹽酸偽麻黃堿對照品（批號為171237 - 201510），鹽酸甲基麻黃堿對照品（批號為171247 - 201502），桂皮酸對照品（批號為110786-201604），桂皮醛對照品（批號為110710 - 201821），均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98.0%；香豆素對照品（江蘇永健醫藥科技有限公司，CAS 號為91 - 64 - 5，純度大于98%）；桂皮醇對照品（南京森貝伽生物科技有限公司，CAS 號為104 - 54 - 1，純度大于98%）；麻黃飲片和桂枝飲片均為市售（藥材信息見表1），經遼寧中醫藥大學李峰教授鑒定為麻黃科植物草麻黃Ephedra sinicaStapf.的干燥草質莖、肉桂Cinnamomum cassiaPresl.的干燥嫩枝，符合2015 年版《中國藥典（一部）》規定。甲醇、乙腈（色譜純，天津賽孚瑞科技有限公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

表1 麻黃-桂枝藥對藥材信息Tab.1 Sources information of Ephedrae Herba-Cinnamomi Ramulus herb pairs

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）- 含0.1%NH4Cl 的0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min 時10%A，10～20 min 時10%A→20%A，20～30 min 時20%A→35%A，30～45 min 時35%A→50%A，45～50 min 時10%A）；流速：1.0 mL/ min；檢測波長：0～20 min 時210 nm（鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿和鹽酸甲基麻黃堿），21～50 min 時250 nm（香豆素、桂皮醇、桂皮酸和桂皮醛）；柱溫：30 ℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取鹽酸甲基麻黃堿對照品28.65 mg、香豆素對照品10.30 mg、桂皮醇對照品17.72 mg、桂皮酸對照品7.468 mg、桂皮醛對照品70.32 mg，精密稱定，置25 mL 容量瓶中，加甲醇超聲處理，并稀釋至刻度，作為混合對照品貯備液Ⅰ。取鹽酸麻黃堿對照品56.75 mg、鹽酸偽麻黃堿對照品22.56 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，精密加入混合對照品貯備液Ⅰ5 mL，加甲醇超聲處理，溶解后稀釋至刻度，配制成每1 mL含鹽酸麻黃堿1 135.00 μg、鹽酸偽麻黃堿451.20 μg、鹽酸甲基麻黃堿114.60 μg、香豆素41.21 μg、桂皮醇70.89μg、桂皮酸29.87μg 和桂皮醛281.30μg 的混合對照品貯備液Ⅱ。精密量取5 mL混合對照品貯備Ⅱ液，置25 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為混合對照品溶液。

供試品溶液：取麻黃、桂枝飲片適量，粉碎，粉末混勻，過50 目篩，分別稱取3.0 g 和2.0 g，精密稱定，置250 mL錐形瓶中，加甲醇50 mL，稱定質量，浸泡50 min，50 ℃超聲（功率為250 W，頻率為40 kHz）提取60 min，放冷，損失的質量用甲醇補足，過濾，取續濾液，于5 ℃、10 000 r/min轉速下高速離心10 min，取上清液，即得。

麻黃、桂枝對照藥材溶液：取上述麻黃、桂枝飲片粉末0.3 g、0.2 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備溶液，即得。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：分別精密吸取2.2 項下3 種溶液各10μL，按擬訂色譜條件進樣測定，7種待測成分與相鄰峰間的分離度均大于1.5，理論板數按鹽酸麻黃堿峰、鹽酸偽麻黃堿峰、鹽酸甲基麻黃堿峰、香豆素峰、桂皮醇峰、桂皮酸峰和桂皮醛峰均大于6 000，拖尾因子均小于1.35。麻黃對照藥材溶液色譜圖中，在無與桂皮醇、桂皮酸、桂皮醛和香豆素對照品溶液色譜相同保留時間處有相應峰，桂枝對照品溶液色譜中無與麻黃堿、偽麻黃堿、甲基麻黃堿相應的峰，表明麻黃與桂枝配伍后，對彼此的成分測定無干擾。色譜圖見圖1。

線性關系考察：分別精密吸取2.2項下混合對照品貯備液0.8，2.0，3.0，5.0，7.0，10.0 mL，置20 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得系列質量濃度的混合對照品溶液，分別精密量取10μL，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以各成分質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。結果見表2。

表2 7種指標性成分線性關系考察結果（n=6）Tab.2 Results of the linear relation test of seven components（n=6）

精密度試驗：精密吸取2.2 項下混合對照品溶液10μL，按2.1 項下色譜條件連續進樣測定6 次。結果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸甲基麻黃堿、香豆素、桂皮醇、桂皮酸和桂皮醛峰面積的RSD分別為0.67%，0.75%，1.15%，1.34%，1.26%，0.99%，1.48%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取樣品（編號為S1）粉末適量，按2.2項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0，5，10，15，20，35，48 h 時按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸甲基麻黃堿、香豆素、桂皮醇、桂皮酸和桂皮醛峰面積的RSD分別為0.43%，0.65%，1.02%，1.32%，0.89%，0.76%，1.54%（n= 7），表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

1.鹽酸麻黃堿 2.鹽酸偽麻黃堿 3.鹽酸甲基麻黃堿 4.香豆素 5.桂皮醇 6.桂皮酸 7.桂皮醛A.混合對照品溶液 B.供試品溶液 C.桂枝對照藥材溶液 D.麻黃對照藥材溶液圖1 高效液相色譜圖1.Ephedrine hydrochloride 2.Pseudoephedrine hydrochlorid 3.Methylephedrine hydrochloride 4.Coumarin 5.Cinnamic alcohol 6.Cinnamic acid 7.CinnamaldehydeA.Mixed reference solution B.Test solution C.Reference medicinal material solution of Cinnamomi Ramulus D.Reference medicinal material solution of Ephedrae HerbaFig.1 HPLC chromatograms

重復性試驗：取樣品（編號為S1）粉末6 份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定。結果鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿、鹽酸甲基麻黃堿、香豆素、桂皮醇、桂皮酸和桂皮醛的平均含量分別為3.021，1.205，0.303，0.165，0.291，1.123，0.126 mg/g，RSD分別為0.35%，0.42%，0.98%，1.31%，1.12%，0.61%，1.25%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取樣品（編號為S1）粉末適量，麻黃飲片粉末1.5 g，桂枝飲片粉末1.0 g，精密稱定，共6份，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入2.2項下混合對照品貯備液4 mL，依法制備供試品溶液，按2.1 項下色譜條件進樣測定。結果見表3。

表3 7種指標性成分加樣回收試驗結果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test of seven components（n=6）

2.4 樣品含量測定

精密量取2.2 項下混合對照品溶液、供試品溶液、麻黃對照藥材溶液、桂枝對照藥材溶液各10μL，按2.1項下色譜條件進樣測定4 批樣品（編號為S1-S4）中7 種成分的含量，結果見表4。采用SPSS 22.0 統計學軟件對4 批麻黃- 桂枝藥對中各成分的含量和其對應單藥材中各成分的含量進行t檢驗數據分析，發現麻黃-桂枝配伍后，除桂皮酸外，其余6 種成分含量均顯著減少（P＜0.05）。

3 討論

3.1 流動相選擇

曾考察乙腈- 0.05%磷酸水溶液、乙腈- 0.05%甲酸水溶液、乙腈-0.2%三乙胺水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液（含0.1%NH4Cl）。結果以乙腈- 0.05%甲酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液為流動相時，由于帶正電荷的堿性化合物麻黃堿與帶負電荷的色譜柱表面硅羥基間的離子交換會引起峰拖尾［11］，導致麻黃堿和偽麻黃堿分離度不符合要求，無法保證含量準確度；以乙腈-0.2%三乙胺水溶液為流動相時，色譜峰峰形有所改善，但各成分保留時間不穩定；以乙腈-0.05%磷酸水溶液（含0.1%NH4Cl）為流動相時，基線較平穩，7 種成分色譜峰與相鄰雜質峰分離完全，對稱因子在1.10～1.35 間，符合系統適應性試驗的規定。故選擇乙腈-含0.1%NH4Cl的0.05%磷酸水溶液為流動相。

3.2 提取條件選擇

曾考察樣品提取方法（超聲、加熱回流）、提取溶劑（甲醇、乙醇、丙酮）、浸泡時間（40，50，60 min）、提取時間（40，60，90 min）、溶劑用量（25，50，100 mL）。結果加熱回流與超聲兩種方式的提取率相當，但加熱回流操作復雜，耗時長，需要的樣品初始濃度較大；以乙醇和丙酮作為提取溶劑時，桂皮醛和麻黃堿的提取率較低，以甲醇作為提取溶劑時，7 種成分的提取率最高，含量測定結果的RSD均小于1.5%；浸泡時間和提取時間分別為50 min 和60 min 時，浸泡和提取較充分；提取溶劑量為50 mL 時。7 種成分響應值適中。故確定甲醇作溶劑、浸泡50 min、超聲處理60 min、提取溶劑量為50 mL為麻黃-桂枝藥對的最佳提取條件。

3.3 麻黃-桂枝配伍化學含量與藥效分析

由表4可知，麻黃-桂枝配伍后，除桂皮酸外，麻黃和桂枝中7種成分的溶出較單味藥材均顯著減少（P＜0.05），與徐文杰等［12］麻黃- 桂枝不同比例配伍前后水煎液中有效成分的含量較單味藥材均減少的研究一致。徐文杰等［13］的研究表明，麻黃-桂枝配伍后，麻黃中麻黃類生物堿的溶出減少，使配伍表現出減毒作用。鄭芳昊［14］的研究發現，麻黃-桂枝藥對配伍后，可使試驗動物的中樞神經系統功能從興奮趨于正常。方芳［15］指出，麻黃- 桂枝配伍后解熱作用增強，說明麻黃- 桂枝藥對配伍后利于解熱，其中麻黃- 桂枝藥對的配伍比例為3∶2 時的解熱作用最佳。由此可知，麻黃類生物堿是麻黃的效、毒兩性成分，麻黃與桂枝相須為用，配伍后麻黃的毒性減弱。但麻黃- 桂枝不同比例配伍后各有效成分的含量及藥之間的關系有待進一步研究。

表4 樣品含量測定結果（mg/g，n=3）Tab.4 Results of content determination of seven components in the samples（mg/g，n=3）