莫匹羅星軟膏微生物限度檢查方法適用性研究及水分活度測定*

李 翠，閔 紅，謝毓華，楊曉莉

（陜西省食品藥品檢驗研究院·國家藥品監督管理局藥品微生物檢測技術重點實驗室，陜西 西安 710065）

莫匹羅星軟膏（2%）是類白色親水性軟膏，主要成分為莫匹羅星，為皮膚科外用抗菌藥物，對革蘭陽性菌的抑制作用較強，常被用于因其引起的膿包、毛囊炎等皮膚感染［1］。目前，國內有6個莫匹羅星軟膏生產企業，關于其微生物限度檢查方法適用性研究較少，且尚無對于多個企業產品微生物限度檢查方法的對比研究［2-3］。水分活度影響微生物生長，作為評價微生物風險和產品穩定性的重要依據，已用于食品和化妝品的風險控制［4-6］。2006年，《美國藥典29-國家處方集42》中收載了《水分活度測定在非無菌制劑中的應用》，以指導水分活度在非無菌制劑中對微生物的控制［7-10］。參考文獻［11-12］，本研究中對6 個生產企業127 批次莫匹羅星軟膏進行了微生物限度檢查方法適用性的驗證，并測定了樣品的水分活度，為企業的產品研發、生產環節控制、產品的放行，以及藥品的監管檢驗提供參考。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥、菌株與培養基

儀器：SX - 500 型蒸汽滅菌器（日本Tomy 公司）；BS2202S型電子天平（德國賽多利斯公司，精度為0.01 g）；IPP260 型生化培養箱（德國Memmer 公司）；VITEK2 型全自動微生物鑒定系統（法國梅里埃有限公司）；CH 型三目顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；Aqualab4TE 型水分活度儀（美國Decagon公司）。

試藥：莫匹羅星軟膏［中美天津史克制藥有限公司（T1），香港澳美制藥有限公司（T2），湖北人福成田藥業有限公司（T3），杭州朱養心藥業有限公司（T4），廣東恒建制藥有限公司（T5），河北九正藥業有限公司（T6），含量均為2%］。

菌株：銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa［CMCC（B）10104］，枯 草 芽 孢 桿 菌Bacillus subtilis［CMCC（B）63501］，金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus［CMCC（B）26003］，白色念珠菌Candida albicans［CMCC（F）98001］，黑曲霉Aspergillusniger［CMCC（F）98 003］，均購于中國醫學細菌保藏管理中心。

培養基：沙氏葡萄糖液體培養基（SDB，批號為200804），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA，批號為200927），胰酪大豆胨液體培養基（TSB，批號為200605），胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA，批號為200909），均購于北京陸橋技術有限責任公司，培養基的適用性檢查均符合2020年版《中國藥典（四部）》要求。

1.2 菌液制備

取1.1項下5種試驗菌，按2020年版《中國藥典（四部）》通則［11］要求，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成適宜濃度的菌懸液，供微生物限度檢查方法適用性檢查用。

1.3 微生物限度計數方法適用性試驗

方法A：1∶10常規法。無菌稱量樣品10 g，加入90 mL TSB 作為稀釋液，制成1∶10（m∶V）供試品溶液。取供試品溶液，分裝于無菌試管中，每管9.9 mL，平行5 管，分別加入1.2 項下5 種試驗菌液，使最終含菌量不大于100 cfu/ mL，作為試驗組。取供試品溶液，分裝于無菌試管中，每管9.9 mL，分別加入TSB 0.1 mL，作為供試品對照組。無菌吸取9.9 mL TSB 稀釋液，分裝于5 管無菌試管中，分別加入1.2 項下5 種試驗菌液，使最終含菌量不大于100 cfu/mL，作為菌液對照組。分別無菌吸取上述3組菌液1 mL，注皿，隨即注入TSA或SDA，按藥典規定條件培養、計數。進行3次重復試驗，計算樣品中5 種試驗菌的回收率。計算公式為回收率（%）=（試驗組菌落數-供試品對照組菌落數）÷菌液組菌落數×100%。

方法B：1∶20 稀釋法。取方法A 項下供試品溶液50 mL，加入50 mL TSB 作為稀釋液，制成方法B 的供試品溶液。其余操作同方法A。

方法C：1∶50 稀釋法。取方法A 項下供試品溶液20 mL，加入80 mL TSB 作為稀釋液，制成方法C 的供試品溶液。其余操作同方法A。

方法D：中和法。將方法A 項下稀釋液替換為含5%聚山梨酯80（V/V）的TSB，制成方法D 的供試品溶液。用含5%聚山梨酯80（V/V）的TSB 代替TSB，作為中和劑對照組。其余操作同方法A。按方法A項下方法計算5種試驗菌的回收率比值和中和劑的回收率。計算公式為中和劑回收率=中和劑對照組/菌液對照組。回收率比值均應在0.5～2.0范圍內。

方法E：1∶20稀釋中和法。取方法D項下供試品溶液50 mL，制成方法E的供試品溶液。其余操作同方法D。

方法F：1∶50稀釋中和法。取方法D項下供試品溶液20 mL，制成方法F的供試品溶液。其余操作同方法D。

方法G：薄膜過濾法（沖洗量為每膜300 mL）。按方法D項下方法制備供試品溶液。先用沖洗液0.1%蛋白胨水溶液潤洗濾膜，同時取100 mL置過濾器中，加入1 mL供試品溶液，過濾，用沖洗液沖洗濾膜，沖洗量為每膜300 mL，分3 次沖洗，在最后1 次沖洗時加入陽性試驗菌液，加菌量不大于100 cfu/ mL，作為試驗組。其余操作同方法D。

方法H：薄膜過濾法（沖洗量為每膜500 mL）。將試驗組沖洗量增加至每膜500 mL，其余操作同方法G。

方法I：中和-薄膜過濾法（沖洗量為每膜300 mL）。試驗組的沖洗液選用含0.1%聚山梨酯80（V/V）的0.1%蛋白胨水溶液，其余操作同方法G。

方法J：中和-薄膜過濾法（沖洗量為每膜500 mL）。沖洗量為每膜500 mL，其余操作同方法I。

1.4 控制菌檢查方法適用性試驗

1.4.1 金黃色葡萄球菌

方法A：直接接種法。按1.3項下方法D制備供試品溶液。取10 mL，接種于TSB 增菌液至100 mL，并接入陽性對照菌液金黃色葡萄球菌，接種量不大于100 cfu/mL，混勻，按規定條件培養。取上述培養物劃線接種，于甘露醇氯化鈉瓊脂選擇性分離平板上培養，有疑似或典型菌落生長時，進行生化試驗或用儀器進行鑒定確認，根據鑒定結果確定方法適用性試驗是否通過。整個試驗過程需進行陽性和陰性對照試驗。

方法B：培養基稀釋法。TSB 增菌培養基的體積增加至200 mL，其余操作同1.4.1項下方法A。

方法C：培養基稀釋法。TSB 增菌培養基的體積增加至400 mL，其余操作同1.4.1項下方法A。

方法D：培養基稀釋法。TSB 增菌培養基的體積增加至800 mL，其余操作同1.4.1項下方法A。

方法E：薄膜過濾法。取1.3 項下方法A 1∶10 供試品溶液10 mL，按1.3項下方法G進行薄膜過濾（沖洗量為每膜300 mL），過濾后取膜接種于TSB 增菌培養基至100 mL。其余操作同1.4.1項下方法A。

方法F：薄膜過濾法。沖洗量增加至每膜500 mL，其余操作同1.4.1項下方法A。

方法G：中和-薄膜過濾法。沖洗液調整為含0.1%聚山梨酯80（V/V）的0.1%蛋白胨水溶液，其余操作同1.4.1項下方法E。

1.4.2 銅綠假單胞菌

方法A：直接接種法。按1.3 項下方法D 制備供試品溶液。取10 mL，接種TSB 至100 mL，同時接入陽性對照菌液銅綠假單胞菌，接種量不大于100 cfu/ mL，混勻，按規定條件培養。取上述培養物接種至溴化十六烷基三甲銨瓊脂選擇性培養基上分離培養，有疑似或典型菌落生長時，進行生化試驗或用儀器進行鑒定確認。整個試驗過程需進行陽性和陰性對照試驗。

1.5 水分活度測定

取127 批次樣品適量，平鋪至測量皿，置已校準的水分活度儀中，平行測定3次，取平均值。

2 結果

2.1 微生物計數方法適用性試驗結果

分別采用10 種方法對6 個生產企業的莫匹羅星軟膏開展了需氧菌計數方法適用性研究。采用方法A-H時，5 種試驗菌中金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均為0，銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率均為50%～200%，樣品對革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌表現出較強的抑制作用，對白色念珠菌、黑曲霉和銅綠假單胞菌無抑制作用或抑制作用可忽略不計，采用此方法不能有效去除樣品的抑菌性，需優化試驗方法；采用方法I 中和- 薄膜過濾法（沖洗量為每膜300 mL）時，T1 和T5 兩個生產企業的枯草芽孢桿菌試驗菌回收率為50%～200%，但其他4 個企業均不能滿足要求；采用方法J 中和薄膜過濾法（沖洗量為每膜500 mL）時，6 個生產企業的試驗菌回收率均為50%～200%，表明采用此方法對6個生產企業的莫匹羅星軟膏進行方法適用性驗證，可有效去除抑菌性，方法適用性試驗通過。

采用方法A 對6 個生產企業的樣品進行霉菌和酵母菌計數方法適用性研究，發現6 個生產企業的2 種試驗菌的回收率均為50%～200%，表明莫匹羅星軟膏對白色念珠菌和黑曲霉無抑制作用或抑制作用可忽略不計，故方法適用性試驗通過。

2.2 控制菌檢查方法適用性試驗結果

采用方法A 直接接種法對6 個生產企業的莫匹羅星軟膏的銅綠假單胞菌進行方法適用性研究，結果銅綠假單胞菌在分離平板上的形態典型，經分離鑒定確認為目標試驗菌，表明此樣品對銅綠假單胞菌無抑制作用，方法適用性試驗通過。采用方法A-F 6種方法對6 個生產企業的莫匹羅星軟膏的金黃色葡萄球菌進行方法適用性研究，均未檢出金黃色葡萄球菌，表明樣品對金黃色葡萄球菌有較強的抑制作用，采用培養基稀釋法、直接薄膜過濾法都不能有效去除樣品的抑菌性，需優化改進試驗方案，建立科學、合理的試驗方法。采用方法G中和-薄膜過濾法時，培養物在甘露醇瓊脂平板上的形態典型，將典型菌落分離純化，采用VITEK2 型全自動微生物鑒定儀鑒定，結果確認為金黃色葡萄球菌，方法適用性試驗通過，表明在沖洗液中加入適量中和劑可有效去除樣品的抑菌性。

2.3 水分活度測定結果

6 個生產企業樣品的水分活度最高值為0.145。結果表1。

表1 6個生產企業樣品水分活度測定結果Tab.1 Determination results of water activity of samples from six manufacturers

3 討論

本研究中分別采用10 種方法對6 個生產企業的莫匹羅星軟膏進行了微生物限度檢查方法適用性驗證，結果顯示，莫匹羅星對革蘭陽性菌有較強的抑菌作用。故首先需消除樣品的抑菌性，才能進行樣品的微生物限度檢查，確保結果的準確、可靠。本研究中采用稀釋法、中和- 稀釋法、薄膜過濾法、中和- 薄膜過濾法等進行了方法優化，發現在供試品溶液和沖洗液中均加入一定濃度的聚山梨酯80后，可消除樣品的抑菌性，各試驗菌的回收率均滿足2020年版《中國藥典（四部）》要求。聚山梨酯80作為一種非離子型表面活性劑，可降低季銨類化合物、酚、醛、對羥基苯甲酸類的活性，用于常見干擾物的中和劑［11，13-17］；在供試品溶液制備和沖洗液中添加有效的中和劑，除可有效去除樣品的抑菌性外，還較稀釋法和薄膜過濾法操作簡單，不易引起污染。故進行抑菌性較強樣品的微生物限度檢查方法適用性研究時，選擇合適的中和劑不僅可快速去除樣品的抑菌性，還可降低檢驗成本，提高檢驗效率。

莫匹羅星的水分活度值較低，不易出現微生物增值現象。本研究中127批次莫匹羅星軟膏的水分活度值均低于0.60，未因生產企業的不同而出現較大幅度的差異。當水分活度低于0.60時，所有微生物都不會出現增殖現象［18-20］，建議檢測樣品的微生物時，可考慮適當減少檢測次數，根據監測實驗室歷史微生物檢查數據和對水分活度的檢測結果，制訂該產品的微生物檢驗周期［7-8］。