苗藥組方二巖虎果無糖顆粒質量標準研究及藥效評價*

饒 海，劉永琴，羅忠圣，3，4，梁芳瑜，徐昌艷，覃容貴△

（1.貴州省貴陽市云巖區人民醫院，貴州 貴陽 550001； 2.貴州醫科大學，貴州 貴陽 550025；3.貴州醫科大學天然產物化學重點實驗室，貴州 貴陽 550014； 4.省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

二巖虎果湯是貴州醫科大學附屬醫院名老中醫饒天培的經驗方，由巖豇豆、巖白菜、虎杖、果上葉4 味苗藥組方。方中巖豇豆化痰止咳、軟堅散結，為君藥；巖白菜收斂止瀉、止血止咳、舒筋活絡，為臣藥；虎杖利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰，為佐藥［1-2］；果上葉潤肺止咳、消炎止痛，為使藥。全方配伍嚴謹，共奏清肺平喘、辛涼宣肺之功效，主治風熱犯肺、痰熱內蘊所致咳嗽、哮喘，臨床用于治療痰熱內蘊所致咳嗽、大葉性肺炎、急性支氣管炎、小兒哮喘等［3］。傳統二巖虎果湯在臨床以湯劑使用，但湯劑口服劑量大，患者服用依從性差，易變質，不方便攜帶，不利于批量生產。故以中醫理論為指導，依據處方藥物的功能主治及現代臨床用藥需要，結合藥物主要成分的性質、技術水平、臨床用藥特點，將湯劑改制成攜帶方便、服用量少、服用方法與傳統湯劑最相似的顆粒劑［4］。本研究中采用薄層色譜（TLC）法對二巖虎果無糖顆粒劑中巖豇豆、巖白菜、虎杖進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定制劑中君藥巖豇豆主要有效成分石吊蘭素的含量，建立了二巖虎果無糖顆粒劑的質量標準，并比較顆粒劑與傳統湯劑的止咳、抗炎作用，以明確其質量標準的合理性與可行性。現報道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

Agilent HPLC1100 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；101 - 1 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海路達實驗儀器有限公司）；AL204 型電子分析天平（梅特勒- 托利多儀器有限公司，精度為萬分之一）；QY-20 型三用紫外分析儀（上海市聞天儀器設備有限公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；AS系列超聲波清洗機（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；薄層層析硅膠GF254薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

甲醇（色譜純，國藥集團化學試劑有限公司）；三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、甲酸、濃硫酸均為分析純，水為娃哈哈純凈水；石吊蘭素對照品（批號為111555 -200602，含量以98.1%計），巖白菜素對照品（批號為111532-200202，含量以94.1%計），大黃素對照品（批號為110756-200110，含量以100%計），石吊蘭對照藥材（批號為120980 - 201005），虎杖對照藥材（批號為121297 - 201003），均購于中國食品藥品檢定研究院；復方巖白菜素片（云南明鏡享利制藥有限公司，批號為111532 - 200202，規格為每片125 mg）；阿司匹林腸溶片（江蘇平光制藥有限責任公司，批號為140601，規格為每片25 mg）；二巖虎果無糖顆粒（自制，批號分別為20160701，20160702，20160703，規格為每袋15 g）；巖豇豆陰性無糖顆粒、巖白菜陰性無糖顆粒、虎杖陰性無糖顆粒（按處方分別稱取缺巖豇豆、巖白菜、虎杖的陰性顆粒）。

1.3 動物

SPF 級健康KM 種小鼠80 只，體質量（20 ± 2）g，雌雄各半，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK（黔）2012 - 0001。所有動物均飼養于潔凈、通風環境中，飼養環境溫度為21～24 ℃、相對濕度為50%～55%，飼養1周后使用。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

巖豇豆［1］92：取3個批號樣品1 g，共3份，研細，加入20 mL 甲醇，超聲提取30 min，過濾，蒸干殘渣，加適量甲醇溶解，制得供試品溶液。分別取巖豇豆陽性無糖顆粒1 g和巖豇豆對照藥材0.1 g，同法制得陰性對照品溶液和對照藥材溶液。另取石吊蘭素對照品適量，加甲醇制得質量濃度為0.2 mg/mL 的對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》TLC 法，分別吸取上述6 種溶液各5μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（5∶2∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，揮干溶劑，噴以2%三氯化鐵乙醇溶液，并于105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置254 nm 波長下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液和對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，詳見圖1 A。

1-3.供試品溶液（批號分別為20160701，20160702，20160703）4.對照品溶液 5.對照藥材溶液 6.陰性對照品溶液A.巖豇豆（254 nm） B.巖白菜（254 nm） C.虎杖（365 nm）圖1 薄層色譜圖1-3.Test solution（batch No.：20160701，20160702，20160703）4.Reference solution 5.Reference medicinal material solution 6.Negative reference solutionA.Lysionotus Herba（254 nm） B.Bergenia Rhizoma（254 nm）C.Polygonum Cuspidatum Rhizoma et Radix（365 nm）Fig.1 TLC chromatograms

巖白菜［1］220，［5］：取3 個批號樣品1 g，共3 份，研細，加入20 mL 甲醇，超聲提取40 min，放至室溫，過濾，取濾液，制得供試品溶液。取巖白菜陰性無糖顆粒1 g，同法制得陰性對照品溶液。另取巖白菜素對照品適量，加入甲醇，制得質量濃度為0.2 mg/mL 的對照品溶液。按2020年版《中國藥典（四部）》TLC 法，分別吸取上述5種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇（4∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，揮干溶劑，置254 nm波長下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，詳見圖1 B。

虎杖［1］217，［6-7］：取3 個批號樣品1 g，共3 份，研細，加入20 mL 甲醇，超聲提取15 min，濾過，殘渣蒸干濾液，加入2.5 mo1/L 硫酸溶液10 mL，回流提取30 min，冷卻，再用三氯甲烷提取2 次，每次5 mL，合并溶液，烘干，殘渣加三氯甲烷1 mL 使溶解，制得供試品溶液。分別取虎杖陰性無糖顆粒和虎杖對照藥材各1 g，同法制得陰性對照品溶液和對照藥材溶液。另取大黃素對照品適量，加入甲醇制得質量濃度為0.1 mg/mL 的對照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》TLC 法，分別吸取上述6 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以苯-乙酸乙酯-甲醇（70∶10∶2，V/V/V）為展開劑，展開，揮干溶劑，置365 nm 波長下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，詳見圖1 C。

2.2 檢查

按2020 年版《中國藥典（四部）》顆粒劑項下規定，對3批樣品的粒度、水分、溶化性、干燥失重、重金屬、砷鹽進行檢查，結果3 批樣品的檢查結果均符合藥典標準。詳見表1。

表1 3批樣品檢査結果Tab.1 Inspection results of three batches of samples

2.3 石吊蘭素含量測定（HPLC 法）

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Dikma-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：甲醇-水（68∶32，V/V）；流速：1 mL/min；檢測波長：334 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20μL。

2.3.2 溶液制備

取石吊蘭素對照品適量，精密稱定，置容量瓶中，加甲醇溶解，制得質量濃度為50μg/mL 的石吊蘭素對照品溶液。取樣品適量，研細，取細粉1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入50 mL 75%甲醇，密塞，稱定質量，超聲處理20 min，放至室溫，精密稱定，加75%甲醇補足減失的質量，搖勻，經0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液，制得供試品溶液。按處方工藝稱取除巖豇豆外的各藥材，制備缺巖豇豆藥材的陰性無糖顆粒劑，并依法制備陰性對照品溶液。

2.3.3 方法學考察［8-9］

專屬性試驗：分別吸取2.3.2 項下3 種溶液適量，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果石吊蘭素色譜峰與其他組分峰可達到基線分離，供試品溶液色譜中在與石吊蘭素對照品溶液色譜相同時間處出現相應色譜峰，陰性對照無干擾。詳見圖2。

1.石吊蘭素A.對照品溶液 B.供試品溶液 C.陰性對照品溶液圖2 專屬性試驗高效液相色譜圖1.LysionotinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.2 HPLC chromatograms of the specific test

線性關系考察：分別精密吸取2.3.2項下對照品溶液1，2，3，4，5 mL，置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容。按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，以石吊蘭素峰面積（Y）為縱坐標、質量濃度為（X，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程Y= 45.52X+ 14.833，r =0.999 6（n=5）。結果表明，石吊蘭素質量濃度在5～50μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密吸取2.3.2 項下供試品溶液，按2.3.1項下色譜條件進樣測定6次，記錄峰面積。結果峰面積的RSD為0.28%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取同一批（批號為20160701）樣品1 g，精密稱定，按2.3.1 項下色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h 時進樣測定。結果含量的RSD為0.35%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

重復性試驗：取同一批（批號為20160701）樣品，共6 份，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算含量。結果含量的RSD為0.33%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批（批號為20160701）樣品，研細，取細粉1 g，精密稱定，共6 份，加入適量石吊蘭素對照品溶液，按2.3.2 項下方法制備供試品溶液，按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，并計算回收率。結果見表2。

表2 石吊蘭素加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test of lysionotin（n=6）

2.3.4 樣品含量測定

分別取3 批（批號分別為20160701，20160702，20160703）樣品各適量，精密稱定，按2.3.2項下方法平行制備2 份供試品溶液，并按2.3.1 項下色譜條件進樣測定，計算含量。結果6份供試品溶液中石吊蘭素的含量分別為31.70，31.29，29.62，30.21，32.17，32.07μg/g，平均含量為31.18 μg/ g，RSD為3.34%（n=6）。將3 批樣品中石吊蘭素含量的平均值下降20%，即樣品中石吊蘭素的含量不得低于24.94μg/g。

2.4 顆粒劑與傳統湯劑的藥效比較［10］

對小鼠氨水引咳試驗的影響：取KM 種小鼠40 只，體質量（20 ± 2）g，雌雄各半，隨機分為空白對照組、傳統湯劑組（1 g/mL）、顆粒劑組（0.387 g/mL）、陽性對照組（復方巖白菜素2.8 mg/mL），各10只。以0.2 mL/10 g劑量灌胃給藥，每天1 次，連續7 d，空白對照組灌胃等量生理鹽水。于末次給藥1 h 后，將小鼠置玻璃鐘罩內，用超聲霧化器定量恒壓噴霧氨水至玻璃鐘罩內，噴霧10 s，取出小鼠，置另一清潔鐘罩內，觀察并記錄小鼠的咳嗽潛伏期和3 min內咳嗽次數。結果見表3。

表3 顆粒劑與傳統湯劑的藥效比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of efficacy between granules and traditional decoction（±s，n=10）

表3 顆粒劑與傳統湯劑的藥效比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of efficacy between granules and traditional decoction（±s，n=10）

注：與空白對照組比較，*P ＜0.05；與傳統湯劑組比較，#P ＞0.05；與復方巖白菜素組比較，△P ＞ 0.05；與阿司匹林組比較，◆P ＞0.05；- 為無數據。Note：Compared with those in the blank control group，*P ＜0.05；Compared with those in the traditional decoction group，#P ＞ 0.05；Compared with those in the compound bergenin group，△P ＞ 0.05；Compared with those in the aspirin group；◆P ＞0.05.- refers to no data.

組別空白對照組復方巖白菜素組阿司匹林組傳統湯劑組顆粒劑組劑量2.8 mg/mL 10 mg/mL 1 g/mL 0.387 g/mL咳嗽潛伏期（s）64.92±6.72 88.90±13.52*#-81.91±16.42*△82.90±6.31*#△3 min咳嗽次數20.87±2.53 15.30±4.22*#-15.70±5.59*△15.03±4.34*#△腫脹抑制率（%）152.18±23.7-120.59±16.58*#132.32±13.40*◆129.44±19.22*#◆

對二甲苯致小鼠耳廊腫脹的影響：分組與給藥方法同小鼠氨水引咳試驗項下，陽性對照組給予阿司匹林10 mg/mL，末次給藥1 h 后，于小鼠右耳兩面均勻涂抹20 μL 二甲苯致炎，40 min 后處死小鼠，用打孔器在小鼠左右耳相同位置打孔，取小鼠左右耳片，稱定質量，計算腫脹抑制率。結果見表3。

由表3 可知，與空白對照組比較，顆粒劑組和傳統湯劑組均可顯著延長小鼠咳嗽潛伏期，降低小鼠3 min內咳嗽次數和小鼠耳腫脹抑制率（P ＜0.05），表明該方藥效良好；與傳統湯劑組比較，顆粒劑組藥效更強，但無顯著差異（P ＞0.05）。結果表明，二巖虎果湯改變原劑型制成顆粒劑的方案科學、合理、可行。

3 討論

中藥制劑的質量標準研究能有效考察制劑的內在質量，是評價藥品安全性的重要依據［11］，同時也反映了中藥制劑指標性成分和毒性成分的含量，進而衡量原料藥和制劑工藝的質量，對于保證中藥制劑質量具有重要意義。

TLC 鑒別時，參考了2020 年版《中國藥典（一部）》方法，并結合實際對展開劑比例、展開時間等因素作了適當調整與優化。根據試驗結果，巖豇豆以三氯甲烷-甲醇-甲酸為展開劑時，雖然分離效果較好，但比移值較高，斑點不清晰，故將展開劑中的三氯甲烷-甲醇換成極性較小的甲苯-乙酸乙酯，而以甲苯-乙酸乙酯-甲酸為（5∶2∶1，V/V/V）展開劑時，對石吊蘭素的分離效果較好，斑點較清晰，且陰性對照無干擾，故選擇甲苯-乙酸乙酯-甲酸作為二巖虎果無糖顆粒中巖豇豆的展開劑。由于巖白菜藥材中含有巖白菜素、熊果苷等成分，且巖白菜素理化性質不穩定，故在對巖白菜素進行TLC 鑒別時考察了三氯甲烷- 乙酸乙酯- 甲醇、石油醚- 乙酸乙酯- 甲醇- 36%乙酸、三氯甲烷- 甲醇等多個展開劑系統，最終確定展開劑為三氯甲烷- 甲醇（4∶1，V/V）。以藥典規定的石油醚- 甲酸乙酯- 甲酸為展開劑對二巖虎果無糖顆粒中虎杖進行TLC 鑒別，結果大黃素的分離效果較差，可能與二巖虎果無糖顆粒由多味藥材組方有關。本研究中對展開劑進行調整與優化，最終以苯-乙酸乙酯-甲醇（70∶10∶2，V/V/V）為展開劑，結果大黃素的分離效果較好，斑點清晰，比移值適中，且陰性對照無干擾，故選其作為展開劑。

中藥顆粒劑受劑型因素影響，易于吸潮，在儲存期間易變質，為保證藥品的質量需控制水分［12］；顆粒劑的粒度與藥物的溶出度、溶化性及灌裝的均勻性有關；重金屬、砷鹽等與顆粒劑的安全性有關［13-14］。故對二巖虎果無糖顆粒進行了上述項目的檢查，結果二巖虎果無糖顆粒檢查項均符合藥典規定，表明二巖虎果無糖顆粒的制備工藝合理、可行。

石吊蘭素是君藥巖豇豆的主要活性成分［15-16］，水溶性較強，可很好地轉移到制劑中，故選擇其作為二巖虎果無糖顆粒定量測定的指標性成分。本研究中測定二巖虎果無糖顆粒自制樣品中石吊蘭素的含量，測得各批樣品分別含石吊蘭素31.50，29.92，32.12 μg/ g，另根據測得的3批樣品中石吊蘭素的平均含量，建議二巖虎果無糖顆粒每袋含巖豇豆以石吊蘭素（C18H16O7）計不得少于0.374 1 mg。

二巖虎果湯的傳統劑型為水煎劑，在顆粒劑的制備過程中課題組采用了水提醇沉工藝，為驗證改變劑型后的顆粒劑的療效不受影響，本研究中采用經典止咳、抗炎藥效動力學試驗比較了顆粒劑與傳統湯劑的藥效，結果顆粒劑的作用較傳統湯劑強，說明在改變劑型的過程中，藥效未改變，所建立的質量標準合理、可行。